王 娟，王建勇，蘇 平，涂俊銘

(湖北師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，湖北 黃石 435002)

藻膽蛋白主要存在于藍(lán)藻、紅藻、隱藻和少數(shù)一些甲藻中 ,其主要功能是作為光合作用的捕光色素蛋白。已知的藻膽蛋白主要可以分為4大類(lèi) ,即藻紅蛋白(Phycoerythrin)、藻藍(lán)蛋白(Phycocyanin)、藻紅藍(lán)蛋白(Phcoerycyanin)和異藻藍(lán)蛋白(Allophycocyanin)[1]。1928年，Lemberg首次證明藻膽蛋白是由脫輔基蛋白和通過(guò)一個(gè)或兩個(gè)硫醚鍵共價(jià)連接藻藍(lán)素(Phycocyanobilins,PCB)——一種開(kāi)鏈四吡咯發(fā)色團(tuán)組成的四吡咯結(jié)構(gòu)的色基所組成[2]，連接位點(diǎn)通常在α84(α亞基第 84位氨基酸)和β84(β亞基第84位氨基酸)等保守位點(diǎn)上[3]。由于藻膽蛋白與植物光敏素在形態(tài)、結(jié)構(gòu)、組成以及光譜特征等方面均十分相似，而且在體外可以誘導(dǎo)藻膽蛋白具有類(lèi)似于植物光敏素的光化學(xué)特征[4]。因此，推測(cè)藻膽蛋白與光敏素之間在功能上可能存在著某種關(guān)系，它們可能起源于同一祖先蛋白，在長(zhǎng)期的進(jìn)化中兩者的功能發(fā)生改變，但在一定的條件下，藻膽蛋白可能會(huì)行使類(lèi)似于植物光敏素的功能。

藻膽蛋白是種天然色素蛋白，具有較強(qiáng)熒光活性(發(fā)橙紅色熒光)，本身則呈紅色、紫色或藍(lán)色等，故被稱(chēng)為有色多肽。藻膽蛋白的水溶性大，無(wú)毒性，色澤鮮艷，熒光明亮，具有抗氧化，增強(qiáng)免疫抑制腫瘤等多種生物活性，因此在食品、化妝品、臨床醫(yī)學(xué)診斷、免疫化學(xué)和生物工程等領(lǐng)域中具有廣闊潛在的應(yīng)用前景和研究開(kāi)發(fā)價(jià)值。藻膽蛋白及其標(biāo)記物在國(guó)際上的售價(jià)相當(dāng)高，研究和開(kāi)發(fā)藻膽蛋白在經(jīng)濟(jì)效益方面有很好的前景[5]；藻膽蛋白是種最具開(kāi)發(fā)潛力的光敏劑，用于腫瘤的光動(dòng)力治療，且在光合作用的原初理論方面具有重要的研究?jī)r(jià)值；藻膽蛋白的水溶液呈亮澤藍(lán)色，可望作為一種高營(yíng)養(yǎng)天然色素應(yīng)用于食品、化妝品領(lǐng)域；利用藻膽蛋白的特殊熒光可作為熒光免疫檢測(cè)中的活性物質(zhì)等[6～8]。

由此可見(jiàn)，在科研實(shí)驗(yàn)及工藝生產(chǎn)中對(duì)增加藻膽蛋白的表達(dá)量及提取純化等是十分有意義的，這能為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究的正常有序進(jìn)行奠定條件基礎(chǔ)[9]。然而，在藻膽蛋白的研究上，國(guó)內(nèi)外大量報(bào)導(dǎo)的主要是集中在藻膽蛋白的提取、結(jié)構(gòu)、功能、基因工程、合成、應(yīng)用及生物活性研究等方面，卻在報(bào)道如何優(yōu)化藻膽蛋白表達(dá)條件的相對(duì)較少。據(jù)薛志欣[10]等報(bào)道，在波長(zhǎng)565和620nm處測(cè)定藻膽蛋白(0～1.2mg/mL內(nèi))具有良好的線(xiàn)性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別為r=0.9995，r=0.9998，該方法測(cè)定藻膽蛋白的回收率分別為99.07%和99.11%.與傳統(tǒng)的Lowry法相比，該方法測(cè)定蛋白簡(jiǎn)便快速，重現(xiàn)性好,只要充分注意避光，加入PBS，用分光光度法來(lái)測(cè)定藻膽蛋白的含量是完全可行的。盡管不同方式提取的藻膽蛋白的吸收峰位置略有不同，但幾乎都有560nm左右的吸收峰[11，12]，所以，本實(shí)驗(yàn)選用560nm作為藻紅蛋白的定量標(biāo)準(zhǔn)，用單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)的研究方法，通過(guò)極差分析和方差分析來(lái)優(yōu)化藻膽蛋白表達(dá)的條件(溫度、誘導(dǎo)劑量和誘導(dǎo)時(shí)間)，從而希望能為實(shí)現(xiàn)藻膽蛋白科研乃至工藝生產(chǎn)規(guī)?；磉_(dá)提取及其開(kāi)發(fā)應(yīng)用奠定一定的理論基礎(chǔ)和參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 含有pACYCDuet-ho1-pcyA、pETDuet-pecE-pecF、pCOLADuet-pecA的E.coliBL21菌種，由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基(1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%NaCl，pH7.2)

1.1.3 試劑與儀器 蛋白胨、酵母提取物為國(guó)產(chǎn)分析純，IPTG(異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)，Amp(氨芐青霉素)、Kan(卡那霉素)為國(guó)產(chǎn)分析純，Chl(氯霉素)為市售醫(yī)用。

UV-2102PC紫外可見(jiàn)光光度計(jì)(尤尼科儀器有限公司)、超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)JY92-Ⅱ(寧波新芝科儀研究所)、高速臺(tái)式離心機(jī)ROTINA35R(Hettich)、GL-20G-11型變速冷凍離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng))。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 儲(chǔ)存液配制 超聲緩沖液(100mmol/L NaCl，0.2mol/L磷酸鉀緩沖液，pH7.2)

Amp儲(chǔ)備液(用無(wú)菌二次重蒸水配成100mg/mL氨芐青霉素(ampicillin，簡(jiǎn)稱(chēng)Amp)溶液，分裝，-20℃保存?zhèn)溆?

Kan儲(chǔ)備液(用無(wú)菌二次重蒸水配成10mg/mL卡那霉素(kanamycin，簡(jiǎn)稱(chēng)Kan)溶液，分裝，-20℃保存?zhèn)溆?

氯霉素(Chl)儲(chǔ)備液(用無(wú)水乙醇配成34mg/mL氯霉素溶液，分裝，-20℃保存)

IPTG儲(chǔ)備液(將2g異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-β-D-galactoside，簡(jiǎn)稱(chēng)IPTG)，溶于二次重蒸水中，過(guò)濾除菌，分裝，-20℃保存?zhèn)溆?/p>

1.2.2 菌種活化培養(yǎng)和表達(dá) 1) 菌種活化 挑取轉(zhuǎn)化單菌落接種于5mL含有目標(biāo)質(zhì)粒的抗生素(氯霉素17μg/mL、氨芐霉素25μg/mL、卡那霉素15μg/mL)的LB培養(yǎng)基中37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。

2) 擴(kuò)大培養(yǎng) 將活化后的菌液接種到50mL的LB培養(yǎng)液的三角瓶中，同時(shí)加入相應(yīng)的抗生素，放恒溫?fù)u床37℃培養(yǎng)。

3) 誘導(dǎo)表達(dá) 每隔1h測(cè)OD600，確保OD600在0.4～0.6之間后，將菌液置于冰水中放置半個(gè)小時(shí)，加入相應(yīng)的IPTG量，在相應(yīng)的溫度下進(jìn)行避光、過(guò)夜誘導(dǎo)。

1.2.3 蛋白提取 1) 將誘導(dǎo)后的菌液離心(5000rpm，5min)收集細(xì)胞，二次蒸餾水洗兩次。

2) 將洗好的細(xì)胞傾去上清液后，重懸于一定量的超聲緩沖液中，用超聲波細(xì)胞粉碎儀進(jìn)行超聲破碎細(xì)胞(220W，工作2s，間隔3s，超聲6min)，然后12000r/min離心15min，得上清稀釋定容為6mL備用。

1.2.4 蛋白含量測(cè)定及計(jì)算 取適量藻膽蛋白上清液，測(cè)定A568值依照公式：A=ξCL(其中：ξ藻膽蛋白在波長(zhǎng)568nm處的摩爾吸光系數(shù)ξ568=96000M-1cm-1;[13]C蛋白上清液物質(zhì)的量濃度；L比色杯內(nèi)徑1cm)，求蛋白濃度。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 培養(yǎng)條件單因素實(shí)驗(yàn) 據(jù)陳思禮[14]等報(bào)道，誘導(dǎo)藻膽蛋白表達(dá)的最適宜的IPTG終濃度為1.0mmol/L，細(xì)胞濃度應(yīng)控制OD600在0.4～0.6間(OD600為0.4和0.6分別處于細(xì)胞生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)早期和對(duì)數(shù)晚期，加入IPTG誘導(dǎo)后進(jìn)入穩(wěn)定期進(jìn)行表達(dá)，對(duì)產(chǎn)物產(chǎn)量沒(méi)有較明顯的影響)，搖床速度為100r/min，因此在各單因素試驗(yàn)中的上述條件相同。

試驗(yàn)因素1：誘導(dǎo)溫度16℃、20℃、24℃、28℃、37℃，誘導(dǎo)時(shí)間12h.

試驗(yàn)因素2：誘導(dǎo)時(shí)間6、8、10、12、14、16h，誘導(dǎo)溫度28℃(試驗(yàn)因素1中得出)。

1.3.2 正交實(shí)驗(yàn) 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分別以誘導(dǎo)劑量、誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)溫度三個(gè)因素為影響因素，以藻膽蛋白表達(dá)含量為考察指標(biāo)，進(jìn)行L9(33)正交試驗(yàn)研究，以確定最佳表達(dá)條件參數(shù)，試驗(yàn)方案如表1所示。

表1 藻膽蛋白表達(dá)的正交試驗(yàn)因素水平表

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 誘導(dǎo)溫度對(duì)藻膽蛋白表達(dá)的影響 由不同溫度下誘導(dǎo)表達(dá)蛋白含量得到圖1，從圖1可以看出，誘導(dǎo)溫度在16℃和28℃時(shí)，藻膽蛋白表達(dá)率較高，在其他溫度條件下，藻膽蛋白產(chǎn)量下降非常明顯。誘導(dǎo)溫度在28℃時(shí)達(dá)到最大，為7.52lmg/100mL.出現(xiàn)上述現(xiàn)象可能是因?yàn)?，?dāng)溫度為28℃時(shí)有利于該重組細(xì)胞的生長(zhǎng)、蛋白的表達(dá)以及脫輔基蛋白與色素的耦合，而催化兩者耦合的酶可能在低溫16℃下的活性較高。結(jié)果說(shuō)明，在其他條件相同的條件下，當(dāng)提高溫度，有利于細(xì)胞的表達(dá)，所以在該套表達(dá)重組體系中，28℃時(shí)蛋白與色素耦合在大腸桿菌體內(nèi)表達(dá)重組效果明顯好于其他溫度，28℃為表達(dá)重組的最適溫度。

圖1 誘導(dǎo)溫度對(duì)藻膽蛋白表達(dá)的影響

2.1.2 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)藻膽蛋白表達(dá)的影響 由不同誘導(dǎo)時(shí)間獲得蛋白含量得到圖2，從圖2中看出，在8h～14h誘導(dǎo)時(shí)間的區(qū)間內(nèi)，藻膽蛋白的表達(dá)量總體上升趨勢(shì)，在誘導(dǎo)時(shí)間8h時(shí)細(xì)胞表達(dá)量就已明顯較高，在12～14h區(qū)間內(nèi)的增加幅度最大，14h后則停止了增加或增長(zhǎng)效果不明顯。從結(jié)果可以分析，誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間太短，蛋白表達(dá)不足，脫輔基蛋白和色素不能最大限度的進(jìn)行自催化重組；表達(dá)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，體內(nèi)產(chǎn)生過(guò)多的藻膽蛋白，這些蛋白在體內(nèi)又可能形成包涵體，從而影響了脫輔基蛋白和色素的自催化重組結(jié)合，同時(shí)，培養(yǎng)基有效營(yíng)養(yǎng)成分隨著細(xì)胞生長(zhǎng)的消耗減少也會(huì)在一定程度上影響了細(xì)胞的增殖生長(zhǎng)，因此在本實(shí)驗(yàn)室條件的綜合考慮下，誘導(dǎo)表達(dá)的最適時(shí)間為14h.

2.2 最佳表達(dá)條件的確定 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上選取誘導(dǎo)表達(dá)溫度、誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間和誘導(dǎo)劑量進(jìn)

行正交實(shí)驗(yàn)，考察這三個(gè)因素對(duì)藻膽蛋白提取率的影響。根據(jù)表1中三因素三水平的條件，設(shè)計(jì)L9(33)正交試驗(yàn)表，采用極差分析與方差分析，以確定藻膽蛋白表達(dá)的最佳條件，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2、表3.

圖2 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)藻膽蛋白表達(dá)的影響

試管號(hào)因素A誘導(dǎo)溫度/℃B誘導(dǎo)時(shí)間/hC誘導(dǎo)劑量/mmol/LA560藻膽蛋白表達(dá)量/(mg/100mL)11(24)1(8)1(0.8)0.2896.021212(12)2(1.0)0.1984.125313(14)3(1.2)0.2465.12542(26)120.193.95852230.3026.29262310.3377.02173(28)130.4299.22783210.1944.04293320.54111.271K115.27119.20617.084K2 17.27114.45919.354K324.54023.41720.644k15.0906.4025.695k25.7574.8206.451k38.1807.8066.881R3.0902.9861.186

2.3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

從表2中藻膽蛋白表達(dá)含量的極差分析(R)可以看出，在三個(gè)影響因素中，誘導(dǎo)表達(dá)溫度和誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間對(duì)其影響較大且兩者的影響程度相近，而誘導(dǎo)劑量的影響較小(即A>B>C).結(jié)果表明，誘導(dǎo)表達(dá)溫度和誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間對(duì)藻膽蛋白表達(dá)影響較大，其主要原因有：溫度是重組細(xì)胞的生長(zhǎng)、蛋白的表達(dá)以及脫輔基蛋白和色素有效結(jié)合的重要條件，它的主要作用體現(xiàn)于對(duì)重組細(xì)胞酶活的影響；誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間對(duì)蛋白的表達(dá)、細(xì)菌質(zhì)粒的拷貝數(shù)、脫輔基蛋白和色素的有效的結(jié)合及培養(yǎng)基有效營(yíng)養(yǎng)成分組成等有重要影響。從結(jié)果還可以看出，隨著誘導(dǎo)溫度的上升和誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，藻藍(lán)蛋白的表達(dá)含量不斷增加。因此，選擇誘導(dǎo)溫度為28℃，誘導(dǎo)時(shí)間為14h.本實(shí)驗(yàn)所選擇的誘導(dǎo)劑量對(duì)于藻膽蛋白的表達(dá)含量影響最小，這一因素的三個(gè)水平中，隨著誘導(dǎo)劑量的增加，藻藍(lán)蛋白的表達(dá)含量也在不斷增加，綜合考慮可知，選擇第二個(gè)水平1mmol/L.綜上分析，在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的范圍內(nèi)，最好的實(shí)驗(yàn)方案為A3B3C2，即誘導(dǎo)表達(dá)溫度為28℃，誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間為14h，誘導(dǎo)劑量為1.0mmol/L.方差分析表明，A、B、C三種因素對(duì)結(jié)果均無(wú)顯著性影響。

表3 因素方差分析

3 討論

本次實(shí)驗(yàn)對(duì)含有三質(zhì)粒pACYCDuet-ho1-pcyA、pETDuet-pecE-pecF、pCOLADuet-pecA大腸桿菌培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。不可否認(rèn)的是，菌株的構(gòu)建是影響蛋白表達(dá)量的關(guān)鍵，好的菌種其自身質(zhì)粒拷貝數(shù)達(dá)到最優(yōu)配比，蛋白表達(dá)數(shù)量和質(zhì)量也最好。其次是外因條件對(duì)蛋白表達(dá)的影響。通過(guò)對(duì)誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)劑量等主要因素研究，采用單因素實(shí)驗(yàn)和正交試驗(yàn)，優(yōu)化了藻膽蛋白表達(dá)的條件。結(jié)果表明，最優(yōu)條件為：誘導(dǎo)表達(dá)溫度為28℃、誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間為14h、誘導(dǎo)劑量為1.0mmol/L.經(jīng)分析，優(yōu)良的菌種在該工藝條件下，可高效表達(dá)藻膽蛋白。其中，誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)表達(dá)量的影響最高。

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