趙潤英，郝偉，孟祥軍，李昭，趙麗妮，馬明洋，丁雙雙

（1.沈陽醫(yī)學(xué)院藥理教研室，機(jī)能實(shí)驗(yàn)中心，藥物研究中心，沈陽 1 1 0 0 3 4；2.中國醫(yī)科大學(xué)9 7期臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)，沈陽 1 1 0 0 0 1；3.沈陽博潤生物技術(shù)有限公司，沈陽 1 1 0 1 6 8）

冠狀動脈再通術(shù)是目前治療急性心肌梗死的重要手段，而缺血再灌注損傷卻成為阻礙缺血心肌從再灌注策略中獲得最佳療效的臨床難題，引起了人們極大的關(guān)注［1］。阿魏酸川芎嗪（ligustrazine ferulate，LF）是以阿魏酸和川芎嗪（ligustrazine，LZ）結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)合成的阿魏酸鹽類化合物。有研究顯示，LF在抗血小板聚集方面表現(xiàn)出較好的藥理活性，且作用強(qiáng)于LZ，但其對心肌缺血再灌注損傷的作用鮮有報(bào)道。本研究旨在探討LF后處理對大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物：健康雄性SD大鼠50只，體質(zhì)量250~300 g，中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物部提供。

1.1.2 儀器：BL-420F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)和HX-100E小動物呼吸機(jī)（成都泰盟科技有限公司）；MiVnt圖像分析系統(tǒng)（上海光學(xué)儀器研究所）；7180全自動生化分析儀（日本HITACHI公司）。

1.1.3 藥品與試劑：鹽酸LZ注射液（20 mg/mL，安徽省立藥業(yè)有限公司）；LF注射液（20 mg/mL，沈陽醫(yī)學(xué)院藥物研究中心）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測測試盒、伊文氏藍(lán)和TTC染液（南京建成生物工程研究所）；TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測試劑盒（瑞士Roche公司）；Fas檢測試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動物分組與心肌缺血再灌注模型的建立：48只雄性SD大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組（SM組）、缺血再灌注組（I/R組）、LZ組和LF組。采用結(jié)扎左冠狀動脈前降支30 min、再灌注120 min的方法，復(fù)制心肌缺血再灌注模型：大鼠20%氨基甲酸乙酯0.7 g/kg腹腔注射麻醉；四肢皮下插入針形電極、右頸動脈插管至左室，連接BL-420 F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，分別記錄Ⅱ?qū)?lián)心電圖和血流動力學(xué)參數(shù)；右頸靜脈置管用于輸液給藥；氣管插管，接呼吸機(jī)；距胸骨左緣0.5 cm處，剪斷第3、4肋骨，打開胸腔，以左心耳與肺動脈圓錐之間的左冠狀靜脈作為結(jié)扎標(biāo)志血管，用3/8弧4×12圓針穿4/0縫線（預(yù)先將一個(gè)帶凹槽的聚乙烯環(huán)穿在縫線上），在左心耳根部下方2 mm處，以深1.5~2 mm、寬2~3 mm穿過心肌表層，縫線兩端在聚乙烯環(huán)的凹槽處結(jié)扎左冠狀動脈前降支（以心電圖顯示ST段抬高為結(jié)扎成功標(biāo)志）30 min；在聚乙烯環(huán)凹槽處剪斷結(jié)扎線，再灌注120 min（以抬高的ST段回落50%為再灌注成功標(biāo)志）。SM組只穿線不結(jié)扎，LZ、LF組于再灌注前10 min頸靜脈注射 LZ、LF 40 mg/kg。

1.2.2 效應(yīng)指標(biāo)檢測

1.2.2.1 血流動力學(xué)指標(biāo) 冠脈下穿好結(jié)扎線后，各組于缺血前（時(shí)點(diǎn) 1）、缺血 30 min（時(shí)點(diǎn) 2）、再灌注 120 min（時(shí)點(diǎn) 3）記錄心率（heart rate，HR）、左室舒張末壓（left ventricular end diastolic pressure，LVEDP）、左室收縮末壓（left ventricular end systolic pressure，LVESP）和心室最大壓力上升和下降速率（±dp/dtmax）等參數(shù)。

1.2.2.2 氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo) 再灌注結(jié)束后右頸動脈采血2 mL，靜置后3 000 r/min離心10 min，檢測血清中MDA的含量、SOD的活性。

1.2.2.3 心肌梗死范圍 右頸動脈采血后經(jīng)頸靜脈注入5%伊文氏藍(lán)1.5 mL，待大鼠口唇藍(lán)染后取出心臟。將左室標(biāo)本置于-20℃冰箱凍存20 min后取出，自心尖向心底平行房室溝方向切出相等厚度的5片心肌片；將切片置預(yù)溫37℃、1%TTC磷酸緩沖液中染色30 min后，再置于10%中性甲醛液中固定24 h；肉眼可見非缺血區(qū)為藍(lán)色、缺血非梗死區(qū)為磚紅色、缺血梗死區(qū)為蒼白色。計(jì)算心肌缺血范圍和心肌梗死范圍，心肌缺血范圍=缺血區(qū)面積（area at risk，AAR）/左室面積（1eft ventricle，LV）×100%，心肌梗死范圍=梗死區(qū)面積（infarct size，IS）/AAR×100%。

1.2.2.4 心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)與凋亡相關(guān)基因表達(dá)將左室于4%甲醛（pH7.4）中固定48 h（4℃）后置于75%乙醇中，然后常規(guī)石蠟包埋，于心肌梗死區(qū)中部沿左室軸線每隔1 mm連續(xù)切取5張3~4 μm厚的切片，烤干備用。TUNEL法檢測凋亡心肌細(xì)胞。在光學(xué)顯微鏡下，凋亡細(xì)胞核呈棕色，正常細(xì)胞呈藍(lán)色。每張玻片隨機(jī)選擇6個(gè)高倍鏡（40×）視野，然后計(jì)算心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)（apoptotic index，AI），AI=凋亡細(xì)胞數(shù)/心肌細(xì)胞總數(shù)×100%。免疫組化法檢測心肌組織Fas蛋白陽性細(xì)胞。在光學(xué)顯微鏡下，細(xì)胞核染成棕色為陽性細(xì)胞。計(jì)數(shù)6個(gè)高倍鏡（40×）視野Fas陽性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算平均陽性細(xì)胞表達(dá)指數(shù)（positive express index，PEI），PEI=陽性細(xì)胞數(shù)/心肌細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以x±s表示，3組及3組以上組間差異采用方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)再用Dunnett法進(jìn)行多個(gè)樣本均數(shù)的兩兩比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LF后處理對大鼠血流動力學(xué)的影響

缺血前各組血流動力學(xué)參數(shù)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；與 SM 組比較，I/R、LZ、LF 組 HR、LVESP、±dp/dtmax等指標(biāo)均降低，LVEDP均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與I/R組比較，LZ、LF能加快HR、升高LVESP和±dp/dtmax、降低LVEDP，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

2.2 LF后處理對大鼠氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的影響

血清生化指標(biāo)檢測結(jié)果顯示：與SM組比較，I/R組血清MDA含量明顯提高，SOD活性明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；LZ、LF能明顯降低血清MDA含量、提高SOD的活性，與I/R組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），但LZ、LF組尚未達(dá)到SM組的水平，與之比較差異仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見表2。

表1 L F對大鼠血流動力學(xué)的影響T a b.1 T h e e f f e c t s o f L Fp o s t c o n d i t i o n i n g o n t h e p a r a me t e r s o f h a e mo d y n a mi c s i n r a t s

2.3 LF后處理對大鼠心肌梗死范圍的影響

伊文氏藍(lán)和TTC雙重染色后檢測心肌梗死范圍結(jié)果顯示：SM組未見缺血區(qū)；除SM組以外，其余各組大鼠的心肌缺血面積無明顯差異（P>0.05）；LZ、LF能明顯縮小大鼠心肌梗死范圍，與I/R組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見表2。

2.4 LF后處理對大鼠心肌細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白Fas表達(dá)的影響

TUNEL法檢測心肌細(xì)胞凋亡與免疫組化法檢測凋亡相關(guān)蛋白Fas表達(dá)的結(jié)果顯示：SM組凋亡心肌細(xì)胞及Fas蛋白陽性細(xì)胞極少；與SM組比較，I/R、LZ、LF各組大鼠凋亡心肌細(xì)胞及Fas蛋白陽性細(xì)胞明顯增多，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。與I/R組比較，LZ、LF能明顯抑制心肌細(xì)胞凋亡和凋亡相關(guān)蛋白Fas的表達(dá)，降低心肌細(xì)胞AI和Fas蛋白的PEI，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。除血流動力學(xué)指標(biāo)外，LF對大鼠氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)、心肌梗死范圍、心肌細(xì)胞AI和Fas蛋白表達(dá)的影響等作用均強(qiáng)于LZ，LF組與LZ組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表 2。

3 討論

心肌缺血再灌注損傷是溶栓、經(jīng)皮冠狀動脈腔內(nèi)血管成形術(shù)或動脈搭橋等冠狀動脈再通術(shù)術(shù)后的重要并發(fā)癥，臨床表現(xiàn)為心臟舒縮功能障礙，如心肌頓抑、心律失常、心力衰竭等［2］。LVESP、LVEDP、±dp/dtmax是評價(jià)心肌收縮功能常用的指標(biāo)，LVESP和+dp/dtmax降低反映左室收縮功能下降，LVEDP升高和-dp/dtmax下降反映左室舒張功能降低。本研究所測血流動力學(xué)指標(biāo)結(jié)果顯示，LF使 HR、LVESP、±dp/dtmax升高，而LVEDP降低，說明LF后處理能提高缺血再灌注大鼠的心肌收縮力，增加心室順應(yīng)性，改善心臟功能。心肌缺血再灌注損傷的發(fā)生機(jī)制至今尚未完全闡明，目前認(rèn)為與氧自由基損傷、鈣超載、能量代謝障礙、血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、細(xì)胞凋亡和中性粒細(xì)胞浸潤等因素有關(guān)［3］，其中大量氧自由基的產(chǎn)生是導(dǎo)致心肌損傷最主要的原因。心肌缺血再灌注時(shí)，氧自由基通過多種途徑生成增加，它與脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)形成脂質(zhì)過氧化物，引起心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。SOD是清除氧自由基所必需的酶，能保護(hù)心肌細(xì)胞免受損傷，其血清活性的高低反映了缺血再灌注心肌抗氧化的能力。MDA是氧自由基攻擊生物膜上的多不飽和脂肪酸引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物，其血清水平的高低反映了機(jī)體受自由基攻擊的嚴(yán)重程度。本研究顯示，LF后處理能明顯提高血清SOD的活性并降低MDA水平，表明外源性LF藥物后處理可提高機(jī)體的抗氧化能力。因此，抑制自由基生成或清除氧自由基可能是LF對大鼠心肌缺血再灌注損傷保護(hù)作用的機(jī)制之一。而氧自由基在引起心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的同時(shí)，還會誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡的途徑主要有兩條，一是通過胞外信號激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡酶caspase，二是通過線粒體釋放凋亡酶激活因子激活caspase。這些活化的caspase可將細(xì)胞內(nèi)的重要蛋白降解，引起細(xì)胞凋亡［4~6］。細(xì)胞凋亡是受基因調(diào)控的精確過程，涉及 ICE、Apaf-1、Bcl-2、Fas、c-myc、p53、ATM等蛋白。Fas又稱作APO-1/CD95，屬TNF受體家族。Fas蛋白與Fas配體結(jié)合后，會激活caspase，導(dǎo)致靶細(xì)胞走向凋亡［7~9］。因此，抑制Fas蛋白的表達(dá)進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡可能是LF對大鼠心肌缺血再灌注損傷保護(hù)作用的另一機(jī)制。

阿魏酸和LZ是活血化瘀中藥川芎、當(dāng)歸的有效成分，臨床廣泛應(yīng)用于缺血性心腦血管疾病的治療，現(xiàn)已人工合成。二者對心肌缺血再灌注損傷均具有保護(hù)作用，并在配伍應(yīng)用中表現(xiàn)出明顯的協(xié)同效果［10］。本研究對以阿魏酸和LZ結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)合成的LF，進(jìn)行了抗缺血再灌注損傷作用與機(jī)制研究，結(jié)果顯示：LF后處理能夠提高抗氧化酶的活性，清除氧自由基，在抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，減少心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的同時(shí)，還能通過下調(diào)凋亡相關(guān)基因Fas蛋白的表達(dá)，抑制心肌細(xì)胞凋亡，從而對心肌缺血再灌注損傷產(chǎn)生良好的保護(hù)作用。

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