付秀美，薛景鳳，付文亮，陳志宏

（承德醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部人體解剖學(xué)教研室，河北 承德 0 6 7 0 0 0）

糖尿病是由于體內(nèi)胰島素絕對(duì)或相對(duì)不足引起的以糖、脂肪、蛋白質(zhì)等代謝紊亂為基礎(chǔ)的一種內(nèi)分泌疾病。糖尿病并發(fā)癥是患者致殘和致死的主要原因，因此，尋找積極有效地預(yù)防糖尿病及其并發(fā)癥的藥物已成為研究熱點(diǎn)。本研究擬利用鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）致糖尿病大鼠模型，探討彩色蠶繭提取物——絲膠預(yù)處理對(duì)糖尿病大鼠胰島細(xì)胞Bax、Bcl-2、胰島素及神經(jīng)肽 Y（neuropeptide Y，NPY）蛋白表達(dá)的影響，為糖尿病的防治提供理論依據(jù)及實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組：清潔級(jí)雄性SD大鼠36只，體質(zhì)量200~250 g，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：712024。將大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組和絲膠組，每組12只。模型組和絲膠組大鼠均采用 2%STZ（25 mg·kg-1·d-1） 連續(xù)腹腔注射 3 d建立動(dòng)物模型，以血糖（blood glucose，BG）≥16.7 mmol/L為成模標(biāo)準(zhǔn)；絲膠組大鼠于注射STZ前給予絲膠（2.4 g·kg-1·d-1）灌胃 35 d。

1.1.2 試劑：絲膠由彩色蠶繭（承德醫(yī)學(xué)院蠶業(yè)研究所提供）經(jīng)浸泡、水煎、過濾、濃縮而成；STZ購自美國Sigma公司，臨用時(shí)用pH4.4的枸櫞酸鈉—枸櫞酸緩沖液配成2%的溶液；血糖檢測(cè)試劑盒購自保定長城臨床試劑有限公司；兔抗胰島素多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司；兔抗NPY抗體購自武漢博士德生物工程有限公司；小鼠抗Bax、Bcl-2單克隆抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 BG檢測(cè)：各組大鼠禁食12 h以上，4%水合氯醛腹腔注射麻醉，經(jīng)內(nèi)眥于眶后靜脈叢采血，3 000 r/min離心20 min，收集血清。應(yīng)用全自動(dòng)臨床生化分析儀酶法檢測(cè)BG。

1.2.2 胰島細(xì)胞相關(guān)蛋白檢測(cè)：取血后斷頭處死大鼠，迅速分離胰腺，部分置于液氮中保存，用于免疫印跡檢測(cè)，其余部分置入Bouins液固定，用于免疫組織化學(xué)檢測(cè)。

免疫印跡法檢測(cè)胰腺Bax和Bcl-2蛋白的表達(dá)：取100 mg胰腺勻漿提取蛋白并定量。取40 μg上樣，12%SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜。小鼠抗Bax單克隆抗體和小鼠抗Bcl-2單克隆抗體（均為1︰200稀釋），4℃過夜，顯影。β-actin做內(nèi)參照。采用Quantity One軟件對(duì)顯影條帶進(jìn)行分析，以Bax/Bcl-2條帶與β-actin條帶的灰度比值作為蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

免疫組化法檢測(cè)胰島細(xì)胞胰島素和NPY蛋白的表達(dá)：常規(guī)石蠟包埋固定胰腺組織，連續(xù)切片（厚度5 μm）。采用SP免疫組化法觀察胰島細(xì)胞胰島素和NPY蛋白的表達(dá)。兔抗胰島素多克隆抗體（1︰400稀釋），兔抗NPY多克隆抗體（1︰50稀釋），DAB顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核。以PBS代替一抗作陰性對(duì)照，以胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。每組隨機(jī)選取5只大鼠，每只大鼠任選5張切片，每張切片選取3個(gè)胰島。采用MiVnt圖像分析系統(tǒng)在400倍顯微鏡下進(jìn)行定量分析，計(jì)算每個(gè)觀察視野內(nèi)陽性產(chǎn)物面積占胰島面積的百分比，取平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示，應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，組間比較用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BG檢測(cè)結(jié)果

模型組 BG 為（29.45±4.82）mmol/L，明顯高于正常組［（10.83±2.03）mmol/L］（P ＜ 0.01）；絲膠組大鼠 BG 為（10.04±2.29）mmol/L，明顯低于模型組（P＜0.01）。提示絲膠預(yù)處理對(duì)糖尿病大鼠BG升高有明顯的預(yù)防作用。

2.2 胰腺Bax和Bcl-2蛋白的表達(dá)

如圖1所示：模型組大鼠胰腺Bax蛋白表達(dá)明顯高于正常組大鼠，Bcl-2蛋白表達(dá)明顯低于正常組大鼠（P＜0.01）。絲膠組大鼠胰腺Bax蛋白表達(dá)明顯低于模型組大鼠，Bcl-2蛋白表達(dá)明顯高于模型組大鼠（P＜0.01）。提示絲膠預(yù)處理對(duì)糖尿病大鼠Bax蛋白表達(dá)升高和Bcl-2蛋白表達(dá)降低有明顯的預(yù)防作用。

2.3 胰島細(xì)胞胰島素蛋白的表達(dá)

胰島素蛋白免疫組化染色陽性產(chǎn)物為棕黃色顆粒，位于細(xì)胞質(zhì)中，陽性細(xì)胞為胰島β細(xì)胞。與正常組大鼠（圖2A）相比，模型組大鼠（圖2B）胰島素表達(dá)明顯降低（P＜0.01）；與模型組大鼠相比，絲膠組大鼠（圖2C）胰島素表達(dá)明顯升高（P＜0.01），定量分析見圖2D。結(jié)果提示絲膠預(yù)處理能明顯抑制糖尿病大鼠胰島β細(xì)胞胰島素表達(dá)的降低。

2.4 胰島細(xì)胞NPY蛋白的表達(dá)

NPY蛋白免疫組化染色陽性產(chǎn)物為棕黃色顆粒，位于細(xì)胞質(zhì)中，陽性細(xì)胞為胰島α細(xì)胞。與正常組大鼠（圖3A）相比，模型組大鼠（圖3B）NPY表達(dá)明顯升高（P＜0.01）；與模型組大鼠相比，絲膠組大鼠（圖3C）NPY表達(dá)明顯降低（P＜0.01），定量分析見圖3D。結(jié)果提示絲膠預(yù)處理能明顯抑制糖尿病大鼠胰島α細(xì)胞NPY表達(dá)的升高。

3 討論

3.1 絲膠預(yù)處理對(duì)糖尿病大鼠胰島細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

胰島β細(xì)胞增殖和凋亡失衡在糖尿病的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用［1］。研究表明，體內(nèi)某些抗凋亡基因表達(dá)增強(qiáng)，可促進(jìn)β細(xì)胞增殖、抑制其凋亡，進(jìn)而對(duì)抗BG的升高［2］。Bcl-2是公認(rèn)的抗凋亡基因，可通過多種途徑抑制細(xì)胞凋亡［3，4］。Bax是促凋亡基因，與Bcl-2有21%的同源性。Bax可互相結(jié)合形成同源二聚體，誘導(dǎo)和促進(jìn)細(xì)胞凋亡；Bcl-2可與Bax競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，形成比Bax-Bax同源二聚體更穩(wěn)定的Bcl-2-Bax異源二聚體，從而使Bax-Bax同源二聚體分開，減弱Bax誘導(dǎo)凋亡的作用［5］。本研究結(jié)果表明：絲膠預(yù)處理可明顯提高糖尿病大鼠Bcl-2表達(dá)水平，降低Bax表達(dá)水平。增多的Bcl-2可通過阻斷凋亡信號(hào)傳遞和凋亡基因產(chǎn)物表達(dá)、提高抗氧化能力來抑β細(xì)胞凋亡，還可與Bax競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合形成Bcl-2-Bax異源二聚體，減弱Bax誘導(dǎo)β細(xì)胞凋亡的作用，從而達(dá)到預(yù)防糖尿病及其并發(fā)癥的目的。

3.2 絲膠預(yù)處理對(duì)糖尿病大鼠胰島細(xì)胞胰島素和NPY蛋白表達(dá)的影響

胰島素是胰島β細(xì)胞分泌的機(jī)體內(nèi)唯一降低BG的激素，在調(diào)節(jié)機(jī)體糖、脂肪和蛋白質(zhì)代謝方面具有重要作用。葡萄糖是胰島β細(xì)胞分泌胰島素的生理調(diào)節(jié)劑，隨BG水平升高，β細(xì)胞功能逐漸降低，胰島素分泌逐漸減少，長期高糖可導(dǎo)致β細(xì)胞不可逆性損傷和凋亡［6］。NPY由胰島α細(xì)胞合成和分泌，通過自分泌和（或）旁分泌方式調(diào)節(jié)胰島素的分泌。NPY可抑制胰島β細(xì)胞分泌胰島素，β細(xì)胞分泌的胰島素也可通過旁分泌作用抑制NPY的合成和分泌［7，8］。本研究結(jié)果表明：絲膠預(yù)處理可通過提高胰島素表達(dá)水平、降低NPY表達(dá)水平來恢復(fù)胰島β細(xì)胞功能并增加β細(xì)胞分泌胰島素，減弱NPY高表達(dá)對(duì)β細(xì)胞分泌胰島素的抑制作用，有效預(yù)防糖尿病的進(jìn)展。

3.3 絲膠的生物學(xué)作用及研究前景

蠶絲是人類最早利用的天然蛋白質(zhì)之一，主要由外圍的絲膠和中心的絲素組成。以往的研究主要集中在絲素方面，約占繭絲成分30%的絲膠作為廢料而丟棄，浪費(fèi)了大量的生物資源。絲膠為高分子水溶性蛋白，由18種氨基酸組成，其中絲氨酸占30%，天冬氨酸和甘氨酸占10%～22%，甲硫氨酸、酪氨酸等含量相對(duì)較少［9］。目前對(duì)絲膠的研究主要集中在美容、護(hù)膚、營養(yǎng)與保健等方面；在治療糖尿病方面的作用僅有國內(nèi)學(xué)者進(jìn)行了初步探討，發(fā)現(xiàn)絲膠可有效降低BG［10］。本研究結(jié)果表明絲膠可以抵抗STZ對(duì)糖尿病大鼠的胰島損傷。此外，由于絲膠是天然的蛋白質(zhì)，避免了化學(xué)合成藥物帶給人體的不良反應(yīng)，因此具有良好的應(yīng)用推廣前景。

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