王燕君，聞?wù)嬲?，?娥，譚志勇，王亞平，劉運(yùn)權(quán)，劉 偉*

(1.東莞市農(nóng)業(yè)種子研究所，廣東東莞 523063; 2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 廣東廣州 510642)

硬葉兜蘭花芽SSH文庫的構(gòu)建

王燕君1，聞?wù)嬲?，張 娥2，譚志勇1，王亞平1，劉運(yùn)權(quán)2，劉 偉2*

(1.東莞市農(nóng)業(yè)種子研究所，廣東東莞 523063; 2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 廣東廣州 510642)

利用SMART策略構(gòu)建了硬葉兜蘭花芽的抑制性消減雜交(SSH)文庫.通過PCR對(duì)文庫中插入的片段進(jìn)行檢測(cè)后，篩選了288個(gè)插入片段為500 bp以上的克隆進(jìn)行測(cè)序.測(cè)序結(jié)果去除載體序列后聚類得到18條差異表達(dá)片段，用BLAST進(jìn)行比對(duì)分析表明，這些差異表達(dá)基因所編碼的蛋白涉及光合作用、合成代謝、基因調(diào)控等功能,其中，包括多個(gè)轉(zhuǎn)座子和反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的同源基因.

硬葉兜蘭(Paphiopedilummicranthum)；抑制消減雜交(SSH)；花發(fā)育

兜蘭(Paphiopedilum)是蘭科植物中最具特色的一個(gè)類群，唇瓣呈兜狀,背萼發(fā)達(dá)，具有艷麗的花紋.兜蘭的兩枚能育雄蕊著生在蕊柱的兩側(cè)，發(fā)達(dá)的背萼呈扁圓形或倒心形，在各瓣中顯著.在觀賞兜蘭生產(chǎn)中，種苗生產(chǎn)和栽培技術(shù)都不完善，而花期調(diào)控問題也難于解決.

目前對(duì)兜蘭的研究集中在生理生態(tài)、栽培和繁殖技術(shù)等方面[1-4]，對(duì)其花發(fā)育的分子生物學(xué)研究尚為空白.本研究以硬葉兜蘭(Paphiopedilummicranthum)為材料，利用抑制性消減雜交技術(shù)(suppression subtractive hybridisation, SSH)，以花芽mRNA(tester，試驗(yàn)方)及營養(yǎng)芽mRNA(driver，驅(qū)動(dòng)方)為樣品，構(gòu)建硬葉兜蘭花芽SSH文庫，分離與其花發(fā)育相關(guān)的差異表達(dá)基因片段，并對(duì)相關(guān)片段的功能進(jìn)行初步分析，以期為闡明硬葉兜蘭花發(fā)育的分子機(jī)制提供重要的信息.

1 材料和方法

1.1材料

硬葉兜蘭栽培于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院溫室.于不同發(fā)育時(shí)期取其營養(yǎng)芽和花芽，-80℃冰箱中保存以備提取總RNA.

試劑和酶：SMARTTMcDNA Library Construction Kit為Clontech公司產(chǎn)品；焦碳酸二乙酯(DEPC)，MOPS，氨卞青霉素鈉鹽，TaqDNA聚合酶，各種限制性內(nèi)切酶和T4 DNA Ligase均購自上海Sangon公司；其它試劑為國產(chǎn)分析純.

1.2方法

1.2.1 總RNA提取 總RNA采用Trizol法提取，利用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，利用紫外分光光度法檢測(cè)質(zhì)量和濃度.

1.2.2 cDNA合成及消減文庫的建立 采用Clontech公司的PCR-SelectTMcDNA Subtraction Kit中的試劑及反轉(zhuǎn)錄酶，合成雙鏈cDNA.以花芽為Tester，營養(yǎng)芽為Driver.按照試劑盒說明書將上述合成的雙鏈cDNA進(jìn)行酶切、接頭連接和消減雜交，稀釋的雜交產(chǎn)物用primer1進(jìn)行32個(gè)循環(huán)的第一輪PCR,產(chǎn)物稀釋后用巢式PCR引物進(jìn)行32個(gè)循環(huán)的第二輪擴(kuò)增.2輪擴(kuò)增后得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)過切膠回收純化后，連接到pMD18-T載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，通過藍(lán)白斑篩選陽性克隆并計(jì)算轉(zhuǎn)化率.

1.2.3 消減效率的分析 分別以消減和未消減的樣品為模板，用上游引物5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′和下游引物5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′進(jìn)行PCR擴(kuò)增甘油醛-3-磷酸脫氫酶(G3PDH)基因，對(duì)18、23、28和33個(gè)循環(huán)的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，根據(jù)G3PDH基因表達(dá)量的變化分析所建文庫的消減效率.

1.2.4 測(cè)序及差異表達(dá)基因功能分析 挑取陽性克隆，用M13通用引物檢測(cè)插入片段.將插入片段大小為500 bp以上的克隆送到上海生工測(cè)序.其測(cè)序結(jié)果去除載體序列后，用DNAstar進(jìn)行聚類，通過BLASTx比對(duì)分析，預(yù)測(cè)相應(yīng)基因的功能及其與硬葉兜蘭花發(fā)育的關(guān)系.

2 結(jié)果與分析

2.1硬葉兜蘭營養(yǎng)芽和花芽總RNA質(zhì)量檢測(cè)

電泳檢測(cè)結(jié)果表明，28S和18S rRNA條帶清晰，說明提取的總RNA完整(圖1).經(jīng)紫外分光光度檢測(cè)，得到營養(yǎng)芽總RNA樣品的OD260/OD280為1.89，花芽的為1.85，說明RNA純度較高，可用作后續(xù)反轉(zhuǎn)錄的模板.

M: DL2000 ladder; 1: total RNA extracted from vegetative buds; 2: total RNA extracted from floral buds.

圖1 硬葉兜蘭營養(yǎng)芽和花芽總RNA

Figure 1 Total RNA extracted from vegetative and floral buds ofP.micranthum

2.2cDNA合成及消減文庫質(zhì)量檢測(cè)

合成的cDNA相對(duì)分子量大小分布于500～2 250 bp之間，呈均勻彌散狀態(tài)(圖2)，質(zhì)量符合后續(xù)酶切實(shí)驗(yàn)的要求.酶切后的花芽cDNA片段加上接頭，作為tester，未加接頭的營養(yǎng)芽cDNA片段為driver，雜交后的cDNA進(jìn)行2輪PCR擴(kuò)增.為分析消減效率，分別以消減及未消減PCR 產(chǎn)物為模板，用G3PDH引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，分別對(duì)18、23、28和

M: 250bp DNA ladder; 1:double-strand cDNAs of vegetative buds; 2: double-strand cDNAs of vegetative buds

圖2 硬葉兜蘭營養(yǎng)芽和花芽雙鏈cDNA

Figure 2 Double-strand cDNAs of vegetative and floral buds ofP.micranthum

33個(gè)循環(huán)的PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析，結(jié)果顯示：與未消減組PCR產(chǎn)物相比，消減組PCR產(chǎn)物中G3PDH 基因產(chǎn)物大大減少，說明所構(gòu)建的消減文庫有一定的消減效率(圖3).

圖3 消減效率分析結(jié)果

經(jīng)過2輪PCR后，差異片段得到富集(圖4)，集中分布于750～1 500bp之間(圖4，Lane1).將第2輪PCR產(chǎn)物純化,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后共獲得445個(gè)陽性克隆.選取其中320個(gè)陽性克隆，以M13通用引物進(jìn)行PCR，電泳檢測(cè)出具有1個(gè)插入片段的克隆300個(gè)，陽性克隆率93.75%；其中插入的片段大小位于250～1 500 bp之間(圖5).

M: DL2000 ladder; 1:secondary PCR product after subtraction; 2: secondary PCR product of un-subtracted samples; 3:primary PCR product after subtraction; 4: primary PCR products of un-subtracted samples

圖4 消減PCR電泳檢測(cè)結(jié)果

Figure 4 Electrophoresis analysis of subtracted PCR products

圖5 文庫中部分陽性克隆PCR鑒定結(jié)果

Figure 5 PCR products of some randomly selected subtracted-library clones

2.3EST分析

EST結(jié)果見表1.在聚類后的18個(gè)EST序列中，3個(gè)沒有同源匹配基因，5個(gè)為未知功能的假定蛋白，其余具有同源序列的特異表達(dá)基因包括與植物細(xì)胞合成代謝相關(guān)的糖原合成酶基因、光合作用相關(guān)基因、基因調(diào)控信號(hào)途徑相關(guān)激酶基因以及與mRNA修飾相關(guān)的基因等.在同源序列比對(duì)中，有多個(gè)與反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子相關(guān)的同源序列，另外還包含1個(gè)轉(zhuǎn)座子序列和1個(gè)可作為分子標(biāo)記的微衛(wèi)星序列.

表1 硬葉兜蘭花芽中特異表達(dá)的序列Table 1 Sequences expressed differentially in floral buds of P. micranthum

3 討論

SSH是一種以抑制PCR為基礎(chǔ)的cDNA 縮減雜交法，1999年BIRCH等[1]第一次將此技術(shù)成功運(yùn)用于對(duì)馬鈴薯晚疫病的研究中.隨后，在蘭花特異基因的分離方面，研究者利用SSH技術(shù)成功獲得了文心蘭假鱗莖中的差異表達(dá)基因[2]、與萬代蘭(VandaMimi Palmer)香氣相關(guān)的基因[3]以及蝴蝶蘭唇瓣突變體中的差異表達(dá)基因[4]，本研究采用SMART cDNA 合成技術(shù)，利用沒有純化的硬葉兜蘭總RNA，成功的構(gòu)建了硬葉兜蘭花芽的SSH文庫，在此基礎(chǔ)上分離得到的在花芽中特異表達(dá)的基因，將為研究硬葉兜蘭花發(fā)育的分子機(jī)理提供基礎(chǔ).

花發(fā)育的分子機(jī)理是近二十多年來植物學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，通過對(duì)模式植物擬南芥的研究，提出了植物開花的幾種途徑以及花器官發(fā)育的ABC模型[5].然而由于蘭花基因組信息的缺失及其轉(zhuǎn)化再生體系的不完善，蘭花花發(fā)育分子基礎(chǔ)的研究落后.研究者從蝴蝶蘭、文心蘭以及石斛蘭中克隆到了大量的與花發(fā)育相關(guān)的基因[6-8]，并在經(jīng)典的ABC模型的基礎(chǔ)上，針對(duì)蝴蝶蘭提出了蘭花花器官發(fā)育的分子調(diào)控模型，認(rèn)為B類MADS-box基因在調(diào)控蘭花花器官的發(fā)育過程中起到關(guān)鍵作用[9].花期調(diào)控方面，已經(jīng)從石斛蘭、蝴蝶蘭等蘭花中分離到與調(diào)控花期相關(guān)的基因[6].然而兜蘭作為蘭花中具有極高觀賞價(jià)值的成員之一，由于資源的有限和栽培技術(shù)、再生體系的不完善，目前的研究大多集中于栽培和繁殖技術(shù)方面，對(duì)其花發(fā)育的研究沒有任何相關(guān)報(bào)道.但花期調(diào)控技術(shù)卻是栽培過程中亟需克服的難題，以硬葉兜蘭為例，人工引種栽培后很少開花，導(dǎo)致人工繁殖和育種都成為難題.本研究通過SSH文庫篩選硬葉兜蘭花芽中的差異表達(dá)基因，可以為研究其花發(fā)育機(jī)理提供基礎(chǔ).但是由于兜蘭乃至蘭科植物基因組信息的缺失，以及現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫中相關(guān)信息的匱乏，人們很難根據(jù)文庫中篩選得到的基因片段在網(wǎng)上搜索到其全部基因信息.因此，本研究中得到的差異表達(dá)片段有多數(shù)功能未能進(jìn)行初步確定，需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究.

通過同源比對(duì)，初步確定功能的差異表達(dá)基因包括與植物細(xì)胞合成代謝相關(guān)的糖原合成酶基因和光合作用相關(guān)基因PsaB，另外還包括MAPK級(jí)聯(lián)信號(hào)通路中的MAPKKK激酶基因.植物中的MAPK級(jí)聯(lián)信號(hào)通路參與脅迫信號(hào)以及激素信號(hào)的傳導(dǎo)[9]，MAPKKK激酶基因在硬葉兜蘭花芽中的差異表達(dá)可能與激素信號(hào)的傳導(dǎo)相關(guān).通過SSH文庫篩選到的差異表達(dá)基因包含一個(gè)與RNA剪切相關(guān)的基因，該基因的表達(dá)與轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控相關(guān).該基因在花芽中差異表達(dá)在硬葉兜蘭花發(fā)育過程中的功能有待進(jìn)一步研究.

本研究分離的在硬葉兜蘭花芽中特異表達(dá)的基因中，含有多個(gè)轉(zhuǎn)座元件(Transposable elements，TEs)同源基因，其中包括轉(zhuǎn)座子、反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子以及轉(zhuǎn)座酶(表1).TE序列是基因組的重要組成部分，在水稻和擬南芥的基因組中，TE分別占29%[10]和10%[11].HSU等利用細(xì)菌人工染色體技術(shù)(BAC)對(duì)蝴蝶蘭的基因組序列進(jìn)行分析表明，有23%的BESs(BAC end sequences)包括重復(fù)DNA序列，其中54.7%為反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子[12].擬南芥中7.8%的EST序列與TE具有同源性，這些基因的產(chǎn)物具有調(diào)節(jié)功能，但不具有結(jié)構(gòu)蛋白的功能[13].TE可以在植物特定發(fā)育階段和特定組織中表達(dá)，參與發(fā)育調(diào)控.在花發(fā)育過程中，也存在TE的特異表達(dá).在春化途徑關(guān)鍵基因BvFLC的上游存在2個(gè)反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子，DNA甲基化水平的降低可能促進(jìn)這2個(gè)反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的激活，從而影響下游BvFLC的表達(dá)，促進(jìn)植株抽薹[14].本研究從硬葉兜蘭花芽中分離到的TE同源基因，可能參與硬葉兜蘭的花發(fā)育調(diào)控過程，其作用將深入研究，有助于進(jìn)一步認(rèn)識(shí)TE在植物發(fā)育中的調(diào)控功能.

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Keywords：Paphiopedilummicranthum; suppression subtractive hybridization (SSH); floral development

ConstructionofSuppressionSubtractiveHybridizationLibraryfromtheFloralBudsofPaphiopedilumMicranthum

WANG Yanjun1, WEN Zhenzhen2, ZHANG E2, TAN Zhiyong1, WANG Yaping1, LIU Yunquan2, LIU Wei2

(1. Institute of Agricultural Seeds, Dongguan 523063, China; 2. School of Life Science, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China)

With high ornamental and research value,Paphiopedilummicranthumis a species of the genusPaphiopedilumnative to China, which is endangered and protected intensively by the country. However, there are few reports on its floral development mechanism because of the supply shortage and backward cultivation technology. In this study, a suppression subtractive hybridization (SSH) library was constructed using the cDNAs from the floral and vegetative buds ofP.micranthumas the tester and the driver, respectively. The insert fragments were tested by PCR, and 288 clones with 500 bp or longer from the library were selected for sequencing. Totally, 18 ESTs were obtained, after vector sequences removed and clustered. The ESTs were functionally annotated by Blast. Those which matched significantly with Nr database were further classified into functional groups including photosynthesis, biosynthetic metabolism, gene regulation, etc. Among them, a few sequences with homology to transposons or retro-transposons were obtained. The genes differentially expressed in floral buds ofP.micranthumisolated in this study could make a base for investigating the molecular mechanism of floral development.

2011-08-31

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2008B020400006)；廣東省良種培育和引進(jìn)專項(xiàng)資金項(xiàng)目(2008-810)；東莞市高等院校科研機(jī)構(gòu)科技計(jì)劃項(xiàng)目(2007108101107)

*通訊作者，liuwei@scau.edu.cn

1000-5463(2012)01-0099-04

Q945.4

A

【責(zé)任編輯 成 文】