張純萍，寧宜寶，宋 立，陳惠娟，習 碩，袁 欣

(1.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081;2.揚州大學，江蘇揚州 225009;3.北京農學院，北京 102206)

沙門氏菌是一種重要的人畜共患病原微生物，它不僅能夠引起雞的各種疾病，而且感染雞耐過后經常成為隱性帶菌者，不定期排毒，從而感染其他雞只并污染周圍環(huán)境，對肉雞的養(yǎng)殖造成很大危害。更為重要的是，肉雞所攜帶的沙門氏菌也是一種重要的食源性病原菌。研究［1-2］表明，人感染腸炎沙門氏菌主要是由于食用了被污染的禽蛋和禽肉所引起。

沙門氏菌血清型眾多，目前已經鑒定出2500多種血清型。不同國家、不同地區(qū)雞群中的優(yōu)勢血清型不同，不同血清型的沙門氏菌對雞和人的致病性也不相同。全球食源性監(jiān)測網的檢測結果表明［3］，引起公共衛(wèi)生安全的沙門氏菌主要以腸炎和鼠傷寒兩種血清型為主。肉雞作為人腸炎沙門氏菌感染的主要來源，美國和歐盟等西方發(fā)達國家早在20世紀90年代就已經開展了對食品動物中沙門氏菌病流行性的調查，而且每年都會發(fā)布監(jiān)測結果報告;歐盟還制定了肉雞腸炎沙門氏菌的嚴格控制措施和控制目標［4-5］，但目前國內對肉雞中沙門氏菌流行狀況的研究和調查資料很少。鑒于此，本研究從2010年4月至2011年10月期間共采集北京地區(qū)28個肉雞養(yǎng)殖場的健康肉雞盲腸或泄殖腔拭子樣品1310份，分離其中的沙門氏菌并進行血清型鑒定，以了解北京地區(qū)健康肉雞沙門氏菌的攜帶情況，從而為北京地區(qū)肉雞場沙門氏菌病的防控和首都的公共衛(wèi)生安全提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 待宰肉雞泄殖腔拭子或屠宰場肉雞的盲腸樣品共1310份，分別采自北京市順義、海淀、懷柔、延慶、平谷等區(qū)縣28個肉雞養(yǎng)殖場的健康肉雞(41～49日齡)，其中每個肉雞養(yǎng)殖場采樣40～50份。樣品采集后4 h內分離沙門氏菌。

1.1.2 培養(yǎng)基 亞硝酸鹽胱氨酸(SC)、沙門氏菌顯色培養(yǎng)基和XLT4培養(yǎng)基均購自青島高科園海博生物技術有限公司;四硫磺酸鈉煌綠(TTB)購自英國Oxoid公司;營養(yǎng)瓊脂由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。

1.1.3 沙門氏菌診斷血清(全套193支) 購于泰國S＆A公司。

1.1.4 分子試劑 PCR buffer、dNTP和 GoTaq DNA聚合酶均由普洛麥格(北京)生物技術有限公司提供;DL2000 DNA Marker購于寶生物工程(大連)有限公司。

1.1.5 引物合成與測序 分別由英俊生物技術有限公司北京合成部和北京測序部完成。

1.2 方法

1.2.1 沙門氏菌的分離與鑒定 根據本實驗室建立的方法［6］進行沙門氏菌的分離，具體為：將泄殖腔拭子或者盲腸樣品用SC和TTB增菌液進行常規(guī)增菌培養(yǎng)，然后分別取1環(huán)增菌液劃線接種于沙門氏菌顯色培養(yǎng)基和XLT4培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)過夜，可疑菌落用營養(yǎng)瓊脂進一步純化。

純化后的菌落用PCR方法［7］進行鑒定。擴增目的片段invA基因的長度為284 bp，上下游引物(5'-3')分別為：gtg aaa tta tcg cca cgt tcg ggc aa和tca tcg cac cgt caa agg aac c，反應條件為：94℃預變性5 min;94℃變性30 s，64℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個循環(huán);最后72℃延伸5 min。PCR產物在1.2%的瓊脂糖凝膠上電泳后進行凝膠成像分析。

1.2.2 沙門氏菌的血清分型 將沙門氏菌接種營養(yǎng)瓊脂平板，37℃培養(yǎng)過夜后根據泰國血清的操作說明和國標中沙門氏菌的檢驗方法［8］分別進行菌體(O)抗原和鞭毛(H)抗原的檢測，以生理鹽水作為陰性對照，與試驗抗血清出現凝集反應者即判定為陽性。根據O抗原和H抗原的檢測結果，參照沙門氏菌屬抗原表［9］判定血清型，記錄結果。

2 結果

2.1 沙門氏菌的分離鑒定結果 本研究總共從1310份樣品中分離鑒定出沙門氏菌54株，總分離率為4.1%。不同養(yǎng)殖場沙門氏菌的分離情況不同，在所采樣的28個肉雞養(yǎng)殖場中，僅從其中的15個養(yǎng)殖場(53.6%)分離到了沙門氏菌，而其余13個養(yǎng)殖場(46.4%)均未分離到沙門氏菌，這15個沙門氏菌陽性肉雞場的分離情況見表1。由表1可見，15個沙門氏菌陽性肉雞場中沙門氏菌的攜帶情況差異很大，攜帶率在2.0% ～16.0%之間。

表1 15個陽性肉雞場沙門氏菌的分離情況和血清分型結果

2.2 沙門氏菌的血清分型 15個陽性肉雞場沙門氏菌的血清型分布見表1。由表1可知，不同肉雞養(yǎng)殖場沙門氏菌的血清型分布不同，但是大多數肉雞養(yǎng)殖場中分離的沙門氏菌均集中于1～2個血清型。總體來看，在所分離的54株沙門氏菌中，腸炎(S.enteritidis)(31.5%)和爪哇安那(S.javiana)(25.9%)為兩種優(yōu)勢血清型，其次是禽傷寒(S.gallinarum)(9.3%)和馬流產(S.abortusequi)(5.6%)沙門氏菌。本研究尚分離到6株II型(薩拉姆亞種，即S.enterica subsp.salamae)和5株不可分型的沙門氏菌。

3 討論

3.1 健康肉雞沙門氏菌的攜帶情況 根據北京地區(qū)肉雞養(yǎng)殖場的分布情況，本研究共調查了該地區(qū)具有代表性的28個養(yǎng)殖場健康肉雞體內沙門氏菌的流行情況，并從其中15個養(yǎng)殖場中分離到了沙門氏菌?？傮w來看，本研究中健康肉雞沙門氏菌的平均攜帶率為4.1%，陽性肉雞養(yǎng)殖場的平均分離率為7.4%，這與其他國家的研究結果相似。歐盟27個成員國在2009年和2010年對肉雞進行的沙門氏菌監(jiān)測結果表明，其平均帶菌率分別為5.0%和4.1%［10］;越南對302份肉雞糞便樣品進行沙門氏菌的檢測，發(fā)現沙門氏菌的攜帶率為7.9%［11］。

本研究中不同養(yǎng)殖場的分離率之間存在較大偏差，這說明健康成雞體內沙門氏菌的攜帶情況與養(yǎng)殖場的飼養(yǎng)管理密切相關［1］。由于禽傷寒、腸炎等血清型的沙門氏菌可通過種雞垂直傳播，因此該分離結果也可能與種雞的沙門氏菌攜帶以及種蛋的污染情況直接相關。歐盟的研究結果表明，2009年和2010年平均分別有2.4%和1.6%的父母代肉種雞感染了沙門氏菌［10］，在我國雖然沒有具體的感染率調查報道，但是種雞與種蛋的沙門氏菌污染水平也不容忽視。

3.2 沙門氏菌的血清型分布 從種屬關系來分，沙門氏菌可以分為邦戈爾和腸道兩個種，腸道沙門氏菌又分為以下6個亞種：腸道亞種、薩拉姆亞種、亞利桑那亞種、雙相亞利桑那亞種、浩敦亞種和因迪卡亞種。根據沙門氏菌菌體(O)抗原、莢膜(Vi)抗原和鞭毛(H)抗原的不同，又可將沙門氏菌分為許多血清型。2007年的WHO抗原表［9］中已經包含2579種血清型，其中絕大多數為腸道沙門氏菌(僅有22種屬于邦戈爾沙門氏菌)。在2557種腸道沙門氏菌中，僅腸道亞種具有具體的血清型名稱(1531個血清型)，其余5個亞種的血清型均以亞種名稱表示。在本研究中，除了11株沙門氏菌(5株不可分型和6株II型)外，其余從健康肉雞體內分離的沙門氏菌均屬于腸道亞種。

本研究中不同養(yǎng)殖場沙門氏菌的血清型分布不同，但是整體來看，最常見的為腸炎沙門氏菌，這與大多數國家所分離到的優(yōu)勢血清型基本一致。美國2010年從肉雞中分離的沙門氏菌主要以腸炎和肯塔基血清型為主［12］;而歐盟2010年分離的主要血清型為腸炎和鴨沙門氏菌［10］。本研究中位居第2的血清型為爪哇安那，占比25.9%，這與越南2001年的沙門氏菌血清型檢測結果［11］類似，但是在美國和歐盟流行性位居前10的沙門氏菌血清型中均未發(fā)現該血清型，因此爪哇安那沙門氏菌的攜帶可能具有地區(qū)性的特點。

研究表明，在大多數國家，90%以上的沙門氏菌都屬于30種左右的血清型［3］，但是近年來有些很少見的血清型又有增加的趨勢［13］。在本研究中，除II型和不可分型的沙門氏菌外，共分離到8個血清型的沙門氏菌;并且大多數肉雞養(yǎng)殖場中分離的沙門氏菌均集中于1～2個血清型，這可能與養(yǎng)殖場長期持續(xù)存在該血清型的感染或者種雞來源相關。由于不同地區(qū)沙門氏菌的血清型分布差異很大，因此非常有必要對全國不同地區(qū)肉雞沙門氏菌的血清型分布進行系統詳細的監(jiān)測，以了解全國肉雞沙門氏菌的攜帶情況。

本研究調查了北京地區(qū)健康肉雞體內沙門氏菌的攜帶情況，為開展全國性的沙門氏菌流行病學調查研究打下了良好的基礎，并為北京地區(qū)肉雞場沙門氏菌病的防控和公共衛(wèi)生安全提供了資料和技術支持。

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