何 允，肖 雄，鄧玉金，趙海龍，李躍民

(西南大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院胚胎工程研究室，重慶 400715)

卵母細(xì)胞的激活是動(dòng)物克隆技術(shù)中的關(guān)鍵步驟之一，應(yīng)用于細(xì)胞核移植及孤雌胚胎干細(xì)胞分離培養(yǎng)等環(huán)節(jié)，可通過(guò)不同途徑實(shí)現(xiàn)[1]。其中SrCl2作為一種常用激活劑，能夠?qū)Ⅱ期卵母細(xì)胞進(jìn)行化學(xué)激活[2]。在激活處理過(guò)程中，透明帶不為胚胎活化發(fā)育所必須[3]，且去透明帶卵母細(xì)胞孤雌激活率高于全胚細(xì)胞直接激活率[4]。故本實(shí)驗(yàn)采用不同濃度SrCl2激活劑對(duì)去透明帶卵母細(xì)胞進(jìn)行激活，在最適作用時(shí)間條件下討論濃度對(duì)激活效果及發(fā)育率的影響。此外本實(shí)驗(yàn)對(duì)孤雌胚胎體外條件培養(yǎng)體系進(jìn)行了優(yōu)化，將常規(guī)培養(yǎng)液培養(yǎng)發(fā)育效果與添加LIF因子培養(yǎng)液培養(yǎng)發(fā)育效果進(jìn)行了比較。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為6～8周齡性成熟昆明系小鼠，購(gòu)自重慶市中藥研究所。

主要試劑:孕馬血清促性腺激素(PMSG)及人絨毛膜促性腺激素(hCG)為寧波第二激素廠生產(chǎn)，SrCl2、LIF因子及其他藥品均購(gòu)自Sigma公司。

1.2 MⅡ期卵母細(xì)胞的獲取

雌性小鼠經(jīng)腹腔注射PMSG10IU/只，48h后注射hCG 10IU/只。注射hCG18h后頸椎脫臼處死小鼠，常規(guī)外科方法無(wú)菌獲取輸卵管。所得輸卵管以M2液漂洗3遍后，撕破膨大部收集卵丘－卵母細(xì)胞復(fù)合體，以0.1%透明質(zhì)酸酶37℃處理3～5min獲得卵母細(xì)胞。

1.3 卵母細(xì)胞去透明帶處理

將上述卵母細(xì)胞以0.5%鏈霉蛋白酶37℃處理1min，待透明帶分層膨脹后以內(nèi)徑略小于透明帶的吸管輕輕吹打至透明帶脫落，所得裸卵細(xì)胞經(jīng)M2液洗滌后放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中備用。

1.4 不同濃度氯化鍶對(duì)去透明帶卵母細(xì)胞的孤雌激活

以 5mmoL/L、10mmoL/L、20mmoL/LSrCl2激活處理去透明帶卵母細(xì)胞6h。將激活后的卵母細(xì)胞移入DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)48h并記錄發(fā)育情況。

1.5 LIF因子對(duì)孤雌胚胎體外成熟的影響

以適宜濃度的SrCl2激活液對(duì)去透明帶卵母細(xì)胞激活處理6h，將激活的卵母細(xì)胞以DMEM培養(yǎng)液或添加10ng/mL LIF的DMEM培養(yǎng)液洗滌3遍，移入DMEM培養(yǎng)液或含LIF的DMEM液滴中培養(yǎng)48h并統(tǒng)計(jì)發(fā)育情況。

1.6 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用SPSS13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(One－Way－ANOVA)。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度氯化鍶對(duì)去透明帶卵母細(xì)胞的激活效果

由表 1 可知，以5mmoL/L、10mmoL/L、20mmoL/LSrCl2對(duì)去透明帶卵母細(xì)胞進(jìn)行6h激活處理，激活率分別為40.38%、46.00%、24.62%。10mmoL/LSrCl2卵裂率與5mmoL/LSrCl2差異不顯著(P＞0.05)，但發(fā)育到桑葚胚階段的細(xì)胞比率顯著高于5mmoL/L(44.00%vs28.85%，P＜0.05);兩組的卵母細(xì)胞卵裂率及桑葚胚率均顯著高于20mmoL/L(P ＜0.05)。

表1 不同濃度對(duì)小鼠去透明帶卵母細(xì)胞孤雌激活的影響

2.2 LIF因子對(duì)孤雌胚胎體外培養(yǎng)效果的影響

以10mmoL/L激活6h的卵母細(xì)胞用不同培養(yǎng)液培養(yǎng)48h后得到表2所示結(jié)果。常規(guī)DMEM培養(yǎng)液中有43.40%活化胚胎發(fā)育到桑葚胚階段，而在LIF+DMEM條件體系下達(dá)到了84.62%桑葚胚率，兩組相比差異顯著(P＜0.05)。

表2 LIF因子對(duì)孤雌胚胎體外培養(yǎng)效果的影響

3 討論

小鼠的卵母細(xì)胞透明帶韌性較大，質(zhì)膜脆弱，使用0.5%鏈霉蛋白酶去除透明帶后能夠提高化學(xué)激活劑效率[5]，使SrCl2激活劑的Sr2+更容易通過(guò)細(xì)胞膜上Ca2+通道進(jìn)入細(xì)胞;Sr2+進(jìn)入細(xì)胞后經(jīng)磷酸肌醇途徑置換內(nèi)源性Ca2+，使細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度上升，從而誘導(dǎo)人工激活卵母細(xì)胞[6]。SrCl2的激活效果受濃度與作用時(shí)間因素影響[7]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:經(jīng)10mmoL/LSrCl2處理的卵母細(xì)胞發(fā)育更易發(fā)育至桑葚胚，效果優(yōu)于5mmoL/L及20mmoL/L實(shí)驗(yàn)組。

LIF因子通常由成纖維細(xì)胞(MEF)飼養(yǎng)層分泌，且其分泌量隨MEF細(xì)胞傳代數(shù)增加而減少[8]。6代以后的MEF細(xì)胞幾乎不再分泌LIF，雜質(zhì)細(xì)胞數(shù)量增加。MⅡ期卵母細(xì)胞經(jīng)孤雌激活后不依靠飼養(yǎng)層就可進(jìn)行體外培養(yǎng)，直接向DMEM培養(yǎng)液添加母源性LIF因子能夠顯著提高胚胎發(fā)育率，并強(qiáng)化其活性[9]。有研究表明，卵母細(xì)胞在2～10ng/L濃度LIF最適作用于其體外成熟率[10]。在本實(shí)驗(yàn)中，去透明帶卵母細(xì)胞經(jīng)SrCl2激活劑作用后，以LIF+DMEM培養(yǎng)48h能夠達(dá)到84.62%桑葚胚發(fā)育率。

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