何海洋，張文靜，谷小溪

(吉林大學 a.地下水資源與環(huán)境教育部重點實驗室;b.環(huán)境與資源學院;c.水資源與環(huán)境研究所，長春 130021)

1 研究背景

地下水人工回灌作為一項水資源管理策略被世界各國高度重視，其目的主要是為了防止和控制地面沉降、增加地下水資源量、防止海水入侵等［1］。特別是近年來地表水受工農業(yè)發(fā)展的影響，有機污染較突出，與地下水水質差異性較大，人工回灌過程對地下水的有機污染不容忽視［2］。

本次研究區(qū)為控制區(qū)域地面沉降，計劃開展相應的地下水人工回灌，而目前在擬采用的回灌水源中監(jiān)測到氯苯等有機組分，因而將氯苯確定為典型有機組分。氯苯是化工生產的重要原料，廣泛存在于基本有機合成、染料、塑料、香料、農藥等生產的廢水中［3］，氯苯是有機化合物(VOCS)的一種，在人體內有蓄積作用，會抑制神經中樞，麻醉肌肉，有較大的毒性，被美國EPA列為優(yōu)先污染物［4］。

國內外學者開展一系列關于氯苯的生物降解實驗研究，從厭氧和好氧條件2個方面開展了氯苯降解菌的篩選、降解特性以及降解能力等方面研究［5］。結果表明:好氧條件下微生物對氯苯的降解速度較快而且能夠徹底的降解氯苯，并釋放出氯離子。厭氧條件下微生物對氯苯的降解速度較慢且容易產生一些致死產物，影響氯苯生物降解作用的進行，而Pardue等［6］認為厭氧條件下有利于微生物對氯苯類有機物進行還原脫氯作用，從而進行氯苯的降解。于海斌(2011年)等研究［7］表明氯苯的降解模型主要有Monod模型和Heukelekian模型。李明堂(2008年)等［8］發(fā)現菌株通過鄰位裂環(huán)途徑降解氯苯，實現氯苯的徹底降解。當氯苯和葡萄糖共存于同一體系時，微生物對氯苯的降解能力下降。許爐生(2011年)等研究［9］表明，生物膜電極法降解氯苯是新型人為降解的途徑。甘平(2001年)等研究［10］表明，馴化的微生物能以氯苯做為唯一碳源和能源實現其徹底降解，還發(fā)現氯苯類有機物中氯取代數越多，越難被微生物降解。

雖然國內外學者關于氯苯的生物降解實驗開展很多，但是基于人工回灌條件下氯苯的生物降解研究還十分缺乏，特別是回灌過程中地下環(huán)境要素對氯苯生物降解行為的影響研究還有待于進一步開展。因此，本文在總結前人研究的基礎上，結合研究區(qū)人工回灌試驗場地的實際條件，開展了人工回灌背景條件下氯苯的生物降解行為研究，以期為人工回灌的全面實施提供技術保障。

2 試驗場地水文地質概況

本次試驗場地占地面積約為75000m2，淺部潛水含水層發(fā)育較差，主要有第一、二、三、四承壓含水層均勻分布。人工回灌的目標含水層是第四承壓含水層，頂板標高在－164.00m，底板標高在－216.50m左右，平均厚度52.55m，產狀近似水平。巖性以灰色細砂、灰色含礫中細砂為主，顆粒組成具有明顯的不均勻性。第四承壓含水層地下水徑流緩慢形成Cl·HCO3－Na型水，礦化度為0.873～0.898g/L，pH 值在7.45～7.61之間，屬于中性水?？傆捕葹?54.34～268.70mg/L，屬于軟水。

3 材料與方法

3.1 主要實驗儀器及實驗材料

實驗儀器:G＆GT2200型電子天平，常熟雙杰測試儀器廠;HZQ2F160恒溫振蕩培養(yǎng)箱，哈爾濱東聯電子技術開發(fā)有限公司;101A2型電熱鼓風干燥箱，上海實驗儀器廠有限公司;UV－5800(PC)紫外可見光分光光度計，上海元析儀器有限公司;7890A安捷倫氣相色譜儀，美國安捷倫公司。

實驗試劑:氯苯(分析純)，上海泰正化工有限公司。氯苯的儲備液制備方法是加入一定量的氯苯至蒸餾水中(466.3 mg/L，20℃)，實驗初始濃度通過逐級稀釋來確定。實驗取樣的氯苯溶液用0.45μm有機系濾膜過濾后用安捷倫7890A氣相色譜儀測試，檢測方法為吹掃捕集/氣相色譜法。氣相色譜條件:①色譜柱:HP－50毛細管色譜柱，恒定流量1.5mL/min，滯留時間1.6min;②柱箱:40℃ (恒定 3 min)，以10℃/min升溫至100℃，維持10min;③檢測器:火焰離子化檢測儀(FID)，溫度 300℃，H2流量40mL/min，空氣流量400mL/min，尾吹25mL/min;④前進樣口:溫度220℃，隔墊吹掃3 mL/min;⑤進樣量:1μL，以保留時間定性，峰面積定量。

實驗材料:實驗用介質取自研究區(qū)第四承壓含水層，在實驗使用前保存在4℃冰箱中，含水介質的物理性質及顆分結果見表1，表2。

表1 介質的物理性質Table 1 Physical properties of soil samples

3.2 實驗方法

為探討回灌過程中地下環(huán)境要素對氯苯生物降解行為的影響，本次根據“夏灌冬用”“冬灌夏用”等回灌特點，設定本次實驗溫度為0，10，20℃，恒溫振蕩培養(yǎng)箱的常用溫度區(qū)間為5～30℃，特殊的0℃溫度的設置是將控溫按鈕調至最低0.1℃，并默認此溫度為0℃。并且，隨著回灌過程所帶來的地下水環(huán)境中溶解氧的變化，實驗設置為好氧和厭氧條件，好氧條件利用的是空氣中的氧氣，厭氧條件是將震蕩器充滿氮氣。

3.2.1 含水層介質對氯苯的生物降解實驗

稱取10 g第四承壓含水層的中細砂8份，分別裝入200mL的玻璃瓶中，向每份樣品中加濃度為稀釋1 000倍的氯苯儲備液100mL，避光，放置在恒溫振蕩器(振蕩速度120 r/min)上。分別在震蕩的1，2，3，5，7，9，12，15 d 取 20mL 氯苯水溶液，測定氯苯的濃度和微生物濃度，所有操作均在無菌條件下進行。

3.2.2 不同濃度條件下的生物降解實驗

根據擬定回灌水源水質的監(jiān)測數據中氯苯濃度值的不同，選取的稀釋濃度范圍將其涵蓋，得到不同的濃度梯度，分別取不同稀釋倍數:100倍、500倍、750倍、1 000倍、3 000倍、5 000倍、10 000倍的氯苯水溶液100mL，裝入200mL的玻璃瓶中，分別與10 g第四承壓含水層中細砂混合，充分振蕩反應后(振蕩時間為實驗3.2.1確定的各溫度以及好氧與厭氧下的平衡時間)取20mL氯苯水溶液測定其濃度和微生物的濃度，所有操作均在無菌條件下進行。

3.2.3 微生物濃度的測試

氯苯溶液中微生物來自研究區(qū)第四承壓含水層的介質，其濃度的高低能夠表征生物降解效果優(yōu)劣。實驗過程中微生物濃度值的確定采用分光光度法(OD660)，取氯苯水溶液過濾后放入比色皿，在660nm下使用UV－5800(PC)測定水樣的吸光度。對OD660標準換算表中的吸光度與微生物濃度進行線性擬合，得到其換算公式(見圖1)，將所測得的吸光度值帶入換算公式，從而得到微生物的濃度，以每毫升溶液中所含菌體個數(107cfu/mL)表示。

表2 介質的顆分結果Table 2 Results of size grading of soil samples %

4 結果與討論

生物降解過程研究的關鍵是回灌含水層中氯苯的生物降解動力學模式、降解的速率，溫度和好氧與厭氧條件對降解速率及降解效果的影響。目前用于描述有機物生物降解過程的模型主要有底物消耗和微生物生長2種模型［11］。前者以一級衰減動力學模型(指數速率模型)最為常見;后者以Monod方程為代表。

圖1 吸光度與微生物濃度的線性擬合Fig.1 Linear-fitting of absorbances and concentrations of microorganisms

4.1 一級衰減動力學模型

一級衰減動力學方程假設有機物的降解速率常數和溶質的濃度成正比，其表達式為

式中:C為被生物降解底物的濃度(μg/L);C0為初始氯苯的濃度(μg/L);λ為速率常數(d－1)。一級反應速率通常用化學物質的半衰期來表示，即

半衰期主要取決于底物性質、濃度和環(huán)境條件。

在基質濃度較低的情形下，降解速率與基質濃度成線性關系，符合一級衰減動力學方程，將式(1)取對數變?yōu)?/p>

根據實驗結果繪制不同條件下氯苯降解曲線，并進行一級衰減動力學方程的擬合(圖2、圖3)，求得氯苯的衰減動力學參數見表3。

圖2 好氧條件下一級衰減動力學方程擬合Fig.2 Fitted curves by first-order decay kinetics equation under aerobic condition

通過圖2、圖3以及表3可知，氯苯在3種不同溫度以及好氧與厭氧條件下的生物降解作用均符合一級衰減動力學方程(R2min＞0.959)，氯苯在好氧與厭氧條件下的生物降解速率λ的大小順序均為20℃＞10℃＞0℃;0，10℃條件下，好氧條件下的生物降解速率要略高于厭氧條件，而20℃時，好氧條件下的生物降解速率要略低于厭氧條件。相應的氯苯在好氧與厭氧條件下的生物降解半衰期t1/2的長短順序為0℃＞10℃＞20℃。0，10℃條件下，厭氧條件下的生物降解半衰期要略長于好氧條件;而20℃時，厭氧條件下的生物降解半衰期要略短于好氧條件。說明了在好氧與厭氧條件下，溫度的升高促進了生物降解反應的進行，降解速率提高，半衰期縮短;在相同溫度條件下，溶解氧的增加對生物降解速率及半衰期的影響不明顯?？梢姕囟仁谴松锝到夥磻闹饕寗右蜃?。

應用阿倫尼烏斯方程［12］可以將溫度對生物降解速率的影響從定性分析到定量分析，阿倫尼烏斯方程為

圖3 厭氧條件下一級衰減動力學方程擬合Fig.3 Fitted curves by first-order decay kinetics equation under anaerobic condition

表3 一級衰減動力學方程的系數Table 3 Coefficients of equations of first-order kinetics of decay

式中:A為指前因子;Ea為表觀活化能(kJ/mol);R為摩爾氣體常量(8.314 J/Kmol);T為絕對溫度(K)。將式(4)取對數得

好氧與厭氧條件，根據3種不同溫度下的λ，進行阿倫尼烏斯方程擬合，擬合結果如圖4。好氧條件下，Ea=23.21 kJ/mol，A=6 307.5;厭氧條件下，Ea=24.27 kJ/mol，A=9 752.7。將其代入到式(4)，得到好氧與厭氧條件下溫度與降解速率的關系式為

從這2個關系式中可以很明顯看出，溫度對于生物降解的正效應作用，溫度升高降解速率加快。

圖4 阿倫尼烏斯方程擬合Fig.4 The Arrhenius equation fitted

將好氧與厭氧條件下生物降解速率做商得到相同溫度條件下的速率比值關系

令式(8)速率比值等于1，求得T=47.24℃，當溫度小于47.24℃時，速率比值大于1。根據地下水人工回灌資料顯示，回灌后溫度最大為21.3℃，就式(8)得出的速率比值而言，相同溫度條件下，好氧降解的速率快于厭氧。一級衰減動力學速率參數顯示與計算的速率比值結論不完全一致，而一級衰減動力學模型并沒有將生物降解過程中微生物濃度變化表征進來，因而需要引入微生物濃度的變化來進一步研究溶解氧對生物降解的影響。

4.2 Monod模型

1942年，Monod采用微生物在單一底物的培養(yǎng)基上進行實驗，探討特定溫度、底物的類型及其濃度等條件下的微生物生長速度和底物濃度之間的關系［11］。Monod方程主要針對單一微生物。在假定各菌種間比例在生長過程中恒定的情況下，也可應用于混合菌群。該方程跨越了零級、混合級到一級的生物降解過程，是最為常用的生物降解動力學方程［13］。Monod 方程式為

式中:C為底物的濃度(μg/L);B為微生物的濃度(μg/L);qmax為基質最大比消耗速率(d－1);ks為半飽和系數(μg/L)。將微分方程式(9)用差分格式近似表示，采用線性化變換，則Monod方程可轉化為

圖5 20℃條件下氯苯的降解微生物曲線及B/Δ-1/C擬合曲線Fig.5 Curves of biodegradation ＆ microorganisms of CB and fitted curves of B/Δ-1/C at 20℃

圖6 10℃條件下氯苯的降解微生物曲線及B/Δ-1/C擬合曲線Fig.6 Curves of biodegradation ＆ microorganisms of CB and fitted curves of B/Δ-1/C at 10℃

從氯苯降解曲線(圖5至圖7)來看，不同溫度和好氧與厭氧下的氯苯的Ct/C0曲線在2 d內都是急速下降，主要是因為在前2 d內介質對氯苯的吸附是主要作用，達到吸附平衡后的主要作用變?yōu)樯锝到庾饔?，然后下降速度減慢，到完全被降解，完全降解的時間好氧與厭氧均為7 d(20℃)，9 d(10℃)，12 d(0℃)，溫度升高促進了降解過程的進行。相同溫度的氯苯降解曲線可以看出，好氧條件下氯苯的降解要略快于厭氧，溶解氧增加促進了生物降解的進行。

從微生物曲線(圖5至圖7)可以看出微生物在以氯苯作為唯一碳源，開始時候微生物增長得比較快，然后趨于緩慢到穩(wěn)定，在降解完成時微生物的濃度(cfu/mL)為:好氧條件下9.3E+05(20℃)，8.7E+05(10℃)，7.9E+05(0℃);厭氧條件下5.6E+05(20℃)，5.0E+05(10℃)，4.1E+05(0℃)。好氧與厭氧條件下，從微生物增長的幅度和數量上都是20℃條件下更加明顯，所以可以得出溫度促進了微生物的生長，就這3種溫度而言，顯然20℃為微生物生長的最佳溫度。而對于相同溫度下，好氧條件下微生物的增長要快于厭氧，由此也可以看出溶解氧的增加促進了微生物的生長，使得生物降解反應的進行加快，效果更好。

根據擬合直線的方程，分別計算氯苯的最大比消耗速率qmax和半飽和常數ks，其結果見表4。

從表4可以看出，qmax在好氧與厭氧條件20，10，0℃ 下分別為1.1182，0.9957，0.8373d－1和0.928 0，0.8431，0.7540d－1，隨著溫度的升高基質最大比消耗速率提高表明氯苯的生物降解速率也隨之提高。而對于相同溫度下，好氧條件下基質最大比消耗速率要快于厭氧，溶解氧促進了微生物的生長，生物降解速率加快。ks在好氧與厭氧條件20，10，0℃ 下分別為291.28，293.11，295.38 μg/L和295.93，296.48，293.06μg/L。ks的大小表示微生物對基質的吸收親和力大小，ks越大，微生物對基質的吸收親和力越小，反之就越大［13］，而Monod模型中的ks的變化很小是由于反應過程中只有溫度和溶解氧的變化沒有基質的變化，微生物對基質的親和力基本上沒變，所以ks變化不明顯。

圖7 0℃條件下氯苯的降解微生物曲線及B/Δ-1/C擬合曲線Fig.7 Curves of biodegradation ＆ microorganisms of CB and fitted curves B/Δ -1/C at 0℃

表4 Monod方程的系數Table 4 Coefficients of Monod equation

4.3 不同初始濃度下氯苯的生物降解

根據實驗結果繪制不同初始濃度的氯苯降解量(Qe)的柱狀圖，一級衰減動力學方程的擬合只能針對濃度較低范圍的，當濃度(C)增高到1 000μg/L以上時就不再適用了［11］。根據不同濃度條件下氯苯的降解量做出柱狀圖(圖8)，從圖中可以看出濃度低于500μg/L時，不同溫度好氧與厭氧條件下的微生物對于氯苯均能降解完全，此后隨著濃度的增加好氧與厭氧的降解量的關系均是20℃＞10℃＞0℃;相同溫度，好氧條件下的降解量高于厭氧。根據柱狀圖的趨勢預測最大的降解量為:好氧條件下35μg/g(20℃)，31μg/g(10℃)，28μg/g(0℃);厭氧條件下30μg/g(20℃)，27μg/g(10℃)，23μg/g(0℃)。隨著氯苯初始濃度的逐漸升高，氯苯降解的量增加。這主要是由于微生物在降解過程中以氯苯作為唯一的碳源，較高濃度的氯苯更有利于微生物的富集，從而使培養(yǎng)初期微生物個體數量增加，生物降解更充分，降解的量增大。

圖8 不同初始濃度下的生物降解量Fig.8 The amounts of biodegradation at different initial concentrations

雖然一級衰減動力學模型中溶解氧對降解速率及半衰期的影響不明顯，但綜合Monod的擬合結果以及不同濃度下的生物降解效果來看，溫度升高和溶解氧的增加促進了生物降解速率的加快，提高了微生物降解氯苯的效果。就回灌過程中的溫度和溶解氧的變化對生物降解的影響來看，選擇夏天回灌，微生物降解氯苯的效果最好。

5 結論

(1)一定濃度條件下氯苯的生物降解反應符合一級衰減動力學和Monod方程，Monod方程得出，溫度升高和溶解氧的增加，降解速率加快，降解效果更好。

(2)阿倫尼烏斯方程能夠量化溫度對生物降解速率的影響。

(3)不同濃度氯苯的生物降解計算出最大的降解量，在好氧與厭氧條件20，10，0℃下分別為35，31，28μg/g和30，27，23μg/g。

(4)就溫度和溶解氧對氯苯生物降解的影響來看，回灌最佳季節(jié)是夏季。

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