周倩倩 李治國(guó) 黃 力

冠心病屬于中醫(yī)學(xué)“胸痹”、“心痛”范疇，血瘀證是冠心病中醫(yī)證候辨證中較常見(jiàn)的癥候類(lèi)型。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在中醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用，為中醫(yī)證型實(shí)質(zhì)的研究提供了新的方法。本研究采用蛋白質(zhì)組學(xué)的相關(guān)技術(shù)方法，分析冠心病血瘀證患者和健康人群之間血清蛋白質(zhì)的差異，以期發(fā)現(xiàn)與冠心病血瘀證相關(guān)的特異性蛋白質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 對(duì)象與分組

冠心病血瘀證患者（疾病組）均為2009年9月～2010年11月中日友好醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合心內(nèi)科門(mén)診及住院病人8例，男女各4例，平均年齡69.50±9.78歲；健康人群（對(duì)照組）8例，均來(lái)自北京中醫(yī)藥大學(xué)體檢正常的健康志愿者，男3例，女5例。病例組西醫(yī)診斷符合 WHO／ISEC制定的《缺血性心臟病的命名和診斷標(biāo)準(zhǔn)》［1］，中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)符合中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)心血管病專(zhuān)業(yè)委員會(huì)于1990年修訂的《冠心病中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn)》［2］，并參考中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)活血化瘀專(zhuān)業(yè)委員會(huì)于1986年制定的血瘀證診斷標(biāo)準(zhǔn)［3］。對(duì)照組無(wú)糖尿病、高血壓、高脂血癥、腎臟疾病及外周血管病變；排除已發(fā)生心肌缺血而目前處于穩(wěn)定期的患者，包括經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影證實(shí)的冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病或陳舊心肌梗塞，或以前曾行經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療（PCI）或冠狀動(dòng)脈搭橋術(shù)后患者。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑和儀器

固相 pH 梯度干膠條（pH3－10NL，24cm）、IPG buffer（pH3－10）、二硫蘇糖醇（DTT）、SDS、Tris均購(gòu)自美國(guó)Amersham Bioscience公司；碘乙酰胺、考馬斯里亮藍(lán)G－250購(gòu)自美國(guó)Amresco公司；四甲基乙二胺（TEMED）、過(guò)硫酸銨（AP）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

IPG phorTM等電聚焦儀（美國(guó)Amersham Pharmacia Biotech公司），Ettan DaltTwelve垂直電泳系統(tǒng)（美國(guó)Parafilm公司），ImageScannerⅢ透射掃描儀、Labscan掃描控制和分析前處理軟件（美國(guó)GE Healthcare公司），PD－Quest圖像分析軟件（美國(guó)Bio－Rad公司），MALDI－TOF－MS質(zhì)譜儀（美國(guó)UltraFlexⅢTOF＆TOF／TOF，Bruker Daltonics公司）。

1.3 血清標(biāo)本的采集和電泳

清晨采集兩組人群外周靜脈血3ml于非抗凝真空采血管中，3 000rpm離心10min，分離血清，于－80℃冰箱內(nèi)貯存?zhèn)溆?。采用Bradford法測(cè)定各血清樣本的蛋白濃度后進(jìn)行雙向凝膠電泳。第一向固相PH梯度等點(diǎn)聚焦（IEF）：于含1mg蛋白的血清樣本中加入1%IPGbuffer，水合液稀釋至450μl，混勻上樣，水化合等點(diǎn)聚焦在20℃進(jìn)行，總電壓為90 000Vh。 具 體 參 數(shù) 如 下：30V12h，250V1h，500V1h，1 000V1h，8 000V30min，8 000V 至90 000 Vh。第二向垂直SDS－PAGE電泳：平衡后的IPG膠條移至12%SDS－PAGE膠上端，加入SDS電泳緩沖液，電泳條件為25℃，2W／gel電泳30min，然后按每塊膠17W的恒功率電泳，直到溴酚藍(lán)指示線(xiàn)到達(dá)凝膠底邊為止。2－DE凝膠固定后以考馬斯亮藍(lán)G－250染色。

1.4 圖像分析和質(zhì)譜鑒定

凝膠脫色后經(jīng)LabScan和ImageScanner透射掃描，運(yùn)用PD－Quest軟件對(duì)各組凝膠圖譜進(jìn)行蛋白點(diǎn)檢測(cè)、標(biāo)準(zhǔn)化、匹配、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，找尋差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)。采用 MALDI－TOF－MS進(jìn)行質(zhì)譜分析，獲得肽質(zhì)量指紋譜（由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)中心完成），運(yùn)用 Mascot軟件搜索Swissprot和NCBInr數(shù)據(jù)庫(kù)，得到差異蛋白質(zhì)的相關(guān)信息。

2 結(jié) 果

2.1 兩組2－DE結(jié)果

對(duì)兩組中單個(gè)血清樣本分別進(jìn)行雙向凝膠電泳分離，分兩次進(jìn)行，第一次3例／組，第二次5例／組，兩組各獲得8個(gè)凝膠圖譜，所得典型的雙向凝膠電泳圖如圖1所示。圖譜信息經(jīng)PD－Quest軟件分析顯示，對(duì)照組及病例組的平均蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)分別為153.60±27.57和146.60±19.99，通過(guò)背景消減、匹配分析，共得到12個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)，其中，部分差異蛋白質(zhì)點(diǎn)的局部放大圖見(jiàn)圖2。

圖1 典型雙向凝膠電泳圖示例

圖2 差異點(diǎn)局部放大圖示例

2.2 質(zhì)譜鑒定結(jié)果

對(duì)12個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析，得到各個(gè)點(diǎn)的肽質(zhì)量指紋譜，如圖3所示。運(yùn)用Mascot軟件搜索Swissprot和NCBInr數(shù)據(jù)庫(kù)，共有11個(gè)點(diǎn)得到陽(yáng)性鑒定，通過(guò)整合重復(fù)蛋白點(diǎn)后，確認(rèn)為6個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)，其中，病例組與對(duì)照組相比，表達(dá)上調(diào)的點(diǎn)有3個(gè)：視黃醇結(jié)合蛋白4（Retinol－Binding Protein 4）、結(jié)合珠蛋白（Haptoglobin）、血清白蛋白（Serum Albumin），表達(dá)下調(diào)的點(diǎn)有1個(gè)：載脂蛋白 A1（Apolipoprotein A－I），在兩次實(shí)驗(yàn)中表達(dá)不一致的點(diǎn)有2個(gè)，為避免實(shí)驗(yàn)的假陽(yáng)性，這2個(gè)點(diǎn)暫不予以考慮，如表1所示。

表1 6個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)

圖3 蛋白質(zhì)點(diǎn)的MALDI－TOF－MS質(zhì)譜結(jié)果示例

3 討 論

視黃醇結(jié)合蛋白4與心血管疾病的關(guān)系在國(guó)外研究中已有報(bào)道［4，5］，認(rèn)為其血清水平的升高可能與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［6，7］，有研究發(fā)現(xiàn)冠心病患者的血清水平明顯高于健康者［8］；國(guó)內(nèi)也有研究得出類(lèi)似結(jié)果［9］。

結(jié)合珠蛋白是一種急性相蛋白［10］，在多種應(yīng)激反應(yīng)過(guò)程中，其血清表達(dá)明顯升高；在抗氧化反應(yīng)、減少細(xì)胞損傷、炎癥反應(yīng)中，結(jié)合珠蛋白也發(fā)揮重要作用［11］。

血清白蛋白是人體血清中含量最豐富的蛋白質(zhì)，研究認(rèn)為其濃度水平對(duì)冠心病的早期發(fā)現(xiàn)及預(yù)后具有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值［12］。國(guó)外一項(xiàng)薈萃分析表明，低血清白蛋白組發(fā)生冠心病及冠心病的死亡風(fēng)險(xiǎn)均明顯高于高血清白蛋白組［13］，同時(shí)國(guó)內(nèi)研究［14］發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，血清白蛋白水平在急性心肌梗死患者組明顯降低，且與其臨床預(yù)后有很好的相關(guān)性。

載脂蛋白A1是高密度脂蛋白（HDL）的主要蛋白成分，能夠促進(jìn)膽固醇的清除，并且在抗炎癥反應(yīng)、抗氧化反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮重要作用［15］，目前研究［16］表明，ApoA1能防止動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生，對(duì)評(píng)價(jià)心血管疾病的危險(xiǎn)程度、心肌梗死及其它心血管事件具有很好的預(yù)測(cè)價(jià)值。

既往對(duì)冠心病血瘀證的客觀化研究［17］發(fā)現(xiàn)，冠心病血瘀證與血液流變學(xué)、微循環(huán)障礙、血脂代謝障礙、血小板功能及抗凝－纖溶系統(tǒng)異常、血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷及免疫功能異常等過(guò)程相關(guān)。國(guó)內(nèi)有研究在利用雙向電泳技術(shù)尋找與心絞痛血瘀證相關(guān)的蛋白時(shí)，發(fā)現(xiàn)了包括載脂蛋白A1、結(jié)合珠蛋白、血清白蛋白等在內(nèi)的與血瘀證相關(guān)的差異蛋白質(zhì)［18］，認(rèn)為不穩(wěn)定心絞痛血瘀證可能是一種炎癥反應(yīng)，同時(shí)與脂代謝紊亂、凝血因子異常、心肌損傷等有關(guān)［19］。而在另一冠心病血瘀證的血漿蛋白質(zhì)組學(xué)研究中［20］，發(fā)現(xiàn)了纖維蛋白原、免疫球蛋白、粒酶等與凝血、內(nèi)皮損傷、免疫炎癥反應(yīng)等相關(guān)的蛋白質(zhì)，可以發(fā)展成為冠心病血瘀證的診斷標(biāo)記物。

本文的研究結(jié)果表明，冠心病血瘀證相關(guān)的蛋白質(zhì)主要集中于炎癥反應(yīng)和脂質(zhì)代謝方面，與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)了像視黃醇結(jié)合蛋白4等具有深入研究意義的蛋白質(zhì)，為進(jìn)一步尋找冠心病血瘀證相關(guān)蛋白提供了線(xiàn)索。由于雙向凝膠電泳技術(shù)存在自身不足和局限性，本研究只得到了與冠心病血瘀證相關(guān)的部分蛋白質(zhì)的信息，隨著技術(shù)的不斷創(chuàng)新和發(fā)展，實(shí)驗(yàn)結(jié)果及其意義會(huì)得到進(jìn)一步驗(yàn)證和完善，其機(jī)制有待進(jìn)一步探索。

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