高一龍 溫 海 張匯東

干細胞治療技術(shù)在犬中的應(yīng)用進展

高一龍 溫 海 張匯東

干細胞(Stem Cells)是一種未充分分化，尚不成熟的，具有自我復(fù)制能力的多潛能細胞，在一定條件下它可以分化成多種功能細胞，是機體的起源細胞，是形成機體各個組織器官的“祖宗細胞”，具備再生各種組織器官的潛在功能，醫(yī)學(xué)界稱之為“萬用細胞”。根據(jù)干細胞所處的發(fā)育階段，可分為胚胎干細胞(embryonic stem cell，ES細胞)和成體干細胞(somatic stem cell)。目前，干細胞技術(shù)的研究主要集中于疾病治療、再生醫(yī)學(xué)和克隆等方向。

雖然大部分的干細胞研究都是針對人類醫(yī)療上的需求，但因為伴侶動物（犬）身體的構(gòu)造及疾?。ㄓ绕涫沁z傳病）與人類相似，所以常被當(dāng)成干細胞研究上的主要常用實驗（模式）動物，這也使得干細胞治療在小動物臨床上有驚人的進展。

干細胞治療脊髓 損傷

韓國建國大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院教授金輝、研究員Jeong Uk-heon研究小組（2009）曾利用人類臍帶血間質(zhì)干細胞(hUCB-MSCs)成功治愈了脊髓受傷導(dǎo)致兩條后腿癱瘓的犬:對癱瘓的犬注入臍帶血干細胞，3周后開始出現(xiàn)恢復(fù)跡象，8周后四肢的運動能力恢復(fù)到正常水平，甚至還可以跳。據(jù)悉，研究小組已經(jīng)在國際學(xué)術(shù)雜志《脊髓神經(jīng)外科(Journal of Neurosurgery Spine)》上發(fā)表了這項研究結(jié)果。 此前，學(xué)界曾有過關(guān)于利用從人骨髓或脂肪提取的干細胞治療犬脊髓損傷的報告，但利用臍帶血干細胞成功治愈，這還是第一次。注入到犬體內(nèi)的干細胞不斷分化，制造出脊髓內(nèi)消失的神經(jīng)細胞，使脊髓損傷恢復(fù)到正常水平。

隨后，該研究小組對基于人臍帶血間質(zhì)干細胞(hUCB-MSCs)治療脊髓損傷(SCI) 的療法又進一步實驗評估和驗證，并觀察了該療法對脊髓損傷犬的長期影響。他們采用了10頭脊髓受傷的犬作為研究對象，7頭在脊髓損傷一星期后移植hUCB-MSCs，而剩下的3頭犬沒有移植。其中2頭移植hUCB-MSCs的犬，一個月后死亡，死于移植后造成的泌尿道感染、褥瘡和敗血癥；3頭沒有移植hUCB-MSCs 的SCI犬從3個月到1年這段觀察期間其運動和感覺功能并沒有改善，且他們的泌尿功能障礙一直持續(xù)到被實施安樂死；而另外5頭移植hUCB-MSCs的犬中有4頭犬后腿功能得到顯著恢復(fù)，這4頭犬的運動和感覺功能在移植后3年逐漸恢復(fù)。研究結(jié)果表明，移植人臍帶血間質(zhì)干細胞治療脊髓損傷犬有積極的治療效果，組織學(xué)檢查顯示，人臍帶血間質(zhì)干細胞能夠顯著提高脊髓損傷犬的髓鞘再生能力。

另外，印度獸醫(yī)泰米爾納德邦和動物科學(xué)學(xué)院也曾應(yīng)用自體干細胞療法，對一頭3歲脊髓損傷的犬開展這項實驗，幫助犬從脊髓損傷中恢復(fù)（2009）。

干細胞治療進行性肌營養(yǎng)不良癥

進行性肌營養(yǎng)不良（progressive muscular dystrophy， PMD）是一組X染色體連鎖隱性遺傳病，患者的肌肉細胞會呈進行性的退化萎縮直至死亡。其中最典型也最嚴重的叫杜氏（Duchenne）進行性肌營養(yǎng)不良，此病是由于患者肌肉細胞中抗肌萎縮蛋白基因的突變造成，使得患者癱瘓或過早的死亡。

犬的進行性肌營養(yǎng)不良癥狀與患PMD的人類極其類似，意大利米蘭San Raffaele研究院的Giulio Cossu研究團隊于2006年在《自然》雜志發(fā)表了一項研究報告：他們應(yīng)用干細胞技術(shù)對罹患肌肉萎縮癥(肌營養(yǎng)不良癥)的黃金獵犬進行治療，已取得重大實驗成效，患病犬頭肌力顯著增強，可以像健康犬一樣跑跳。該項實驗成果可能預(yù)示著對治療人類危害極大的杜氏進行性肌營養(yǎng)不良（漸凍癥）具有積極意義。

Cossu教授領(lǐng)導(dǎo)的研究團隊首先從健康犬的肌肉血管中取出mesoangioblast干細胞，在實驗室中將其擴增培養(yǎng)到足夠數(shù)量，然后在5個月時間里分批次陸續(xù)將數(shù)千萬個mesoangioblast干細胞注射到罹患杜顯氏肌肉萎縮癥的犬血管內(nèi)；這些犬的免疫系統(tǒng)在實驗前已受到抑制以免產(chǎn)生排斥?；加羞M行性肌營養(yǎng)不良的黃金獵犬通常在8個月大時，行走就會產(chǎn)生困難，而這些經(jīng)過干細胞治療的患犬行走能力要強得多，有一頭經(jīng)過干細胞治療的黃金獵犬甚至在13個月大時，還能行走。

研究者對經(jīng)干細胞治療的患病實驗犬肌肉組織進行檢測，發(fā)現(xiàn)這些mesoangioblast干細胞通過血液轉(zhuǎn)移，然后從毛細血管慢慢擴散到實驗犬全身的肌肉組織中，這些mesoangioblast干細胞與肌肉組織中原先存在的肌肉纖維融合，產(chǎn)生了肌肉細胞中原先不存在的抗肌萎縮蛋白，并使得原先的肌肉纖維更新。但是，如果用來自正常供體犬的干細胞進行移植這種方法來治療杜氏進行性肌營養(yǎng)不良的患者，效果并不完美，因為這樣被治療的患犬，需要終身服用抗排異藥物來防止發(fā)生排異反應(yīng)。

所以，這項實驗的下一步是嘗試修正患病犬的自體細胞，以使這些犬無需繼續(xù)施打抗排斥藥物。Cossu研究團隊試圖尋找到解決這一問題的方法，他們從患有進行性肌營養(yǎng)不良的實驗犬的血管中采集mesoangioblast干細胞，因為，這些實驗犬的mesoangioblast干細胞同樣缺失抗肌萎縮蛋白基因，所以研究者用慢病毒載體將外源的抗肌萎縮蛋白插入患病實驗犬的mesoangioblast干細胞的細胞核，然后再將這些經(jīng)過修復(fù)的mesoangioblast干細胞回注到實驗犬的體內(nèi)。這些被移植了經(jīng)過修復(fù)后的自體mesoangioblast干細胞的患病犬的肌肉細胞中產(chǎn)生了抗肌萎縮蛋白，但是它們的癥狀沒有得到改善。Cossu分析可能是因為用了截短的抗肌萎縮蛋白，所以沒有能改善這些實驗犬的癥狀?？辜∥s蛋白基因是人類基因組中最大的一個基因，長度達到250萬個堿基對，無法載入較安全的相關(guān)病毒載體，這是目前全世界的科學(xué)家用基因治療的方法治療杜氏進行性肌營養(yǎng)不良的遇到的首要難題。若要解決這一問題，可能需要用不同版本的抗肌萎縮蛋白，插入這些患病犬的mesoangioblast干細胞。

長期來看，如果這種自體干細胞移植療法行得通，患者就可以不用終身服用免疫抑制劑。而目前如果不服用免疫抑制劑，這些受試犬在接受健康犬的干細胞后，將會很快再次喪失行走能力。Cossu教授已計劃進行臨床試驗，初步做法將采用已在患病犬身上獲得成效的方法，亦即使用從捐贈者身上取得的干細胞。他預(yù)測若要讓肌肉萎縮的病患移植經(jīng)基因修正的自體干細胞，還得需要幾年時間。

干細胞治療骨關(guān)節(jié)損傷

賽馬和賽犬等競技動物，因為經(jīng)常比賽會發(fā)生嚴重的骨關(guān)節(jié)損傷，這也使得獸醫(yī)在外科手術(shù)的同時，積極尋求應(yīng)用干細胞技術(shù)方法非損傷性治療骨關(guān)節(jié)疾病的方法。鑒于間質(zhì)干細胞能夠分化成骨、軟骨、肌腱和韌帶的組成細胞（以及肌肉，脂肪，可能還有其它組織），有科學(xué)家試圖研究利用成年來源的間質(zhì)干細胞，來治療動物骨頭、軟骨、韌帶、及肌腱上的這些組織的損傷或缺損疾病。間質(zhì)干細胞主要來源于脂肪組織或骨髓，由于異體間質(zhì)干細胞的接種可能會造成排斥，所以間質(zhì)干細胞通常是采取自體移植的方式。但在一些研究犬及馬的骨折修復(fù)手術(shù)中，所采用的間質(zhì)干細胞并沒有誘發(fā)免疫排斥反應(yīng)，相反的此類問質(zhì)干細胞可以促進骨折處的骨組織再生。已有相關(guān)的文獻證實，可以利用脂肪組織或骨髓來源的干細胞來治療肌腱和韌帶受傷的馬匹。

干細胞技術(shù)克隆犬

韓國干細胞治療技術(shù)研究公司RNL Bio 2009年1月29日稱，該公司和首爾國立大學(xué)合作以取自犬脂肪組織的干細胞成功克隆了兩頭黑色小犬，這是全球首例使用干細胞技術(shù)克隆犬。此前，英國、日本、美國和新西蘭的科學(xué)家都曾成功用干細胞克隆出綿羊、豬、老鼠和鹿。2005年，首爾國立大學(xué)成功利用普通皮膚細胞制造了全球第一頭克隆犬“首努比”（阿富汗獵犬）。應(yīng)用干細胞技術(shù)成功克隆犬類動物這還是第一次，首爾國立大學(xué)克隆項目的負責(zé)人李秉川認為在基因研究領(lǐng)域，干細胞比普通細胞更有優(yōu)勢。

RNL Bio公司的負責(zé)人羅鄭贊稱，公司計劃對干細胞克隆技術(shù)進行商業(yè)推廣。應(yīng)用該技術(shù)，寵物犬的主人就可以事先儲存犬的干細胞，等到愛犬生病時可以使用干細胞給犬治病，甚至在犬去世后，還可以利用干細胞克隆一模一樣的犬。

結(jié) 語

干細胞治療技術(shù)作為一種新型的疾病治療手段，它克服了臨床常規(guī)治療的局限性，為動物和人類疾病的治療打開了全新的思路，展示出廣闊的應(yīng)用前景，干細胞治療技術(shù)在組織工程領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用?？梢灶A(yù)想，在不遠的將來，開展干細胞的研究，定向培養(yǎng)與生產(chǎn)犬的各種組織器官，可以為因執(zhí)行任務(wù)受槍傷、刀傷或生病的警犬，進行器官移植，對保持和恢復(fù)警犬的戰(zhàn)斗力大有益處。

但是干細胞治療是目前最復(fù)雜的生物療法，有許多的技術(shù)難點尚未突破，其確切的療效和安全性有待驗證，尚不能在臨床上廣泛應(yīng)用。干細胞治療技術(shù)的操作標準、產(chǎn)品質(zhì)量控制等問題也需進一步規(guī)范。

（作者單位：公安部南京警犬研究所，210012）

（編輯：李 冰）