葉偉峰 ，田 允，黃繼云，廖美華，陶蓉蓉，張根生，樓宜嘉，韓 峰

(1.浙江大學醫(yī)學院附屬兒童醫(yī)院，浙江 杭州 310003;2.浙江大學藥理毒理與生化藥學研究所，浙江 杭州 310058)

工業(yè)及環(huán)境來源的鉛污染構(gòu)成對人類長期的危害。鉛會通過血腦屏障(blood-brain barrier，BBB)進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)進而產(chǎn)生神經(jīng)毒性作用。大量研究表明，鉛可誘導活性氧的產(chǎn)生，促使細胞和組織產(chǎn)生自由基并導致氧化損傷。眾多研究提示，自噬/溶酶體途徑(autophagy-lysosome pathway)是真核細胞降解蛋白質(zhì)及功能失調(diào)的細胞器的重要途徑，其作為一種防御機制可清除胞質(zhì)內(nèi)的細胞器、代謝產(chǎn)物，進行亞細胞水平的重構(gòu)，在參與維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)過程中發(fā)揮著重要作用。然而，作為一把雙刃劍，同時它也是一種細胞死亡程序誘導細胞主動性死亡，過度的細胞自噬就會引起細胞過量損傷而導致自噬性死亡。有報道認為鉛暴露會導致附睪上皮細胞自噬增加［1］。Likholat 等［2］在鉛對肺部蛋白水解系統(tǒng)影響的研究中發(fā)現(xiàn)，大鼠肺吸入0.01%醋酸鉛1 周后組織蛋白酶B(cathepsin B)表達上調(diào)，吸入2個月后會大量激活cathepsin B。然而，由于鉛的神經(jīng)毒性機制有許多方面尚不清楚，有關(guān)自噬/溶酶體信號在神經(jīng)毒性方面的研究資料更少，其許多關(guān)聯(lián)性問題有待繼續(xù)研究。本研究通過對自噬體膜標志性蛋白質(zhì)的檢測，側(cè)重于探索慢性鉛暴露條件下海馬腦區(qū)是否存在著自噬/溶酶體途徑的激活。

1 材料與方法

1.1 動物分組與處理 健康成年SD 大鼠，體重雌性220～250 g，雄性250～280 g，清潔級，購自浙江省實驗動物中心，動物合格證號為SCXK(浙20080033)。大鼠每天給12 h 的光照，適應性飼養(yǎng)1 周。實驗孕鼠隨機分成3組，分別為對照組、低劑量鉛暴露組(0.5 g/L)和高劑量鉛暴露組(2.0 g/L)，按組每窩分籠飼養(yǎng)。對照組給予蒸餾水，低劑量組和高劑量組分別給予醋酸鉛飲用水，孕鼠自孕16天起自由飲用直至新生仔鼠21天斷乳為止［3］。斷乳期仔鼠與母鼠分開按組每窩分籠飼養(yǎng)，仔鼠開始飲用與母鼠相同含量的醋酸鉛飲用水直至60天成熟期，進行血樣與腦組織樣取材并測定。各劑量醋酸鉛飲用水均為現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2 子鼠血鉛濃度與腦組織鉛含量測定 將新鮮抗凝血標本與標準品同時用10%硝酸消化后，10 000 r/min 離心5 min，取上清液20μl，加入石墨管，使用石墨爐原子吸收分光光度法上機檢測，測定波長為283.3 nm。由標準品作一條鉛原子吸光度與濃度的標準曲線，每管標本根據(jù)其鉛原子的吸光度，在標準曲線上讀得相應的血鉛濃度。將濃硝酸與高氯酸按體積4∶1配置成混合酸消化液，將1 ml 消化液分別加入各放置新鮮海馬腦組織的玻璃試管中，在自控電熱消化器上將樣本組織加熱到120 ℃消化4 h，后升溫至260 ℃，消化至完全干燥，冷卻后灰分加入去離子水溶解定容成1 ml，搖勻待測。腦組織鉛測定使用石墨爐原子吸收分光光度法［4］，吸500μl 至上樣杯，然后進行上機檢測，測定波長為283.3 nm。測定后得到腦組織鉛測定值(以μg/dl 表示)換算成腦組織鉛含量。

1.3 Western blot 檢測海馬腦區(qū)自噬相關(guān)蛋白表達 凍存的海馬腦組織參考文獻報道方法［5］先加入裂解緩沖液(含有50 mmol/L pH 7.5 Tris-HCl，0.5% Triton X-100，4 mmol/L EGTA，10 mmol/L EDTA，1 mmol/L Na3VO4，30 mmol/L Na2P2O7·10H2O，50 mmol/L NaF，50μg/ml leupeptin，25μg/ml pepstatin A，50μg/ml trypsin inhibitor 和1 mmol/L dithiothreitol)并勻漿，然后4 ℃，15 000×g 離心10 min，取上清待用。用Lowry 試劑盒法對蛋白濃度進行定量。含等量總蛋白的樣品采用SDS-PAGE 電泳分離［6］。蛋白上樣量為10～20μg/道，SDS-PAGE后使用PVDF 膜，將蛋白在180 mA 電流條件下轉(zhuǎn)膜1 h，膜在用含5% 脫脂奶粉的TBST 封閉液中室溫封閉1 h，然后加入各對應的抗體:Beclin 1 抗體(1∶2 000);微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)抗體(1∶2 000);溶酶體相關(guān)膜蛋白2(lysosomal-associated membrane protein 2，LAMP2)抗 體(1∶2 000);β-actin 抗 體(1∶5 000)。4 ℃搖床上孵育過夜，次日用TBST 緩沖液室溫在搖床上洗膜3次，每次10 min，后加相應二抗(1∶5 000)搖床上室溫孵育膜60 min，然后相同條件下用TBST 緩沖液室溫搖動洗膜3次。用ECL 試劑盒使膜上的免疫活性蛋白顯色。膠片上蛋白條帶經(jīng)掃描后用Quantity one軟件進行光密度分析定量。

1.4 免疫細胞化學法檢測cathepsin B 蛋白表達 待檢測腦組織樣本4%多聚甲醛固定，PBS洗3次，每次5 min;再用2% BSA 封閉1 h，PBS 洗3次，每次5 min;一抗cathepsin B 抗體(monoclonal antibody，1∶200);4 ℃孵育過夜。次日用PBS 洗3次，每次5 min，二抗Alex594標記兔二抗(稀釋度1∶200)，室溫孵育2 h。再用PBS 洗3次，每次10 min。封片后用共聚焦顯微鏡觀察，拍照記錄。

1.5 統(tǒng)計學處理 GraphPad Prism 5(GraphPad Software Inc.，San Diego CA)統(tǒng)計分析軟件處理所得數(shù)據(jù)，使用單因素方差分析及Bonferroni 方法作Post-hoc 檢驗，各計量資料均以平均值±標準差()表示，P＜0.05 時表示有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 慢性鉛暴露后子代大鼠血鉛濃度與腦組織鉛含量測定 統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，低劑量與高劑量鉛暴露組血鉛濃度均高于對照組(4.94±1.34)μg/L，分別為(97.83±24.66)μg/L 和(217.72±43.50)μg/L，具有顯著性差異(P＜0.01，圖1A)。與此相一致，海馬腦區(qū)鉛含量測定結(jié)果顯示，低劑量鉛暴露組海馬腦鉛含量(1.26±0.31)μg/g 與高劑量鉛暴露組海馬腦鉛含量(1.83±0.18)μg/g 明顯高于對照組(0.52±0.13)μg/g，差異有顯著性(P＜0.01，圖1B)。

圖1 慢性鉛暴露后子代大鼠血鉛濃度與海馬腦組織鉛含量的變化Fig.1 Changes of lead content in blood and hippocampus in chronic lead-exposed rats

2.2 慢性鉛暴露下子代大鼠海馬腦區(qū)Beclin 1表達變化 研究結(jié)果顯示，與對照組相比，子代大鼠海馬自噬相關(guān)蛋白Beclin 1 表達量在低劑量鉛暴露后有明顯下調(diào)(P＜0.05)，而高劑量鉛暴露組Beclin 1 表達量卻顯著上調(diào)(P＜0.05，圖2)。

圖2 子代大鼠慢性鉛暴露后海馬Beclin 1 的表達變化Fig.2 Changes of Beclin 1 levels in hippocampus following chronic lead exposure in rats

2.3 慢性鉛暴露下子代大鼠海馬腦區(qū)LC3 表達變化 用Western blot 檢測LC3-Ⅱ與LC3-Ⅰ在慢性鉛暴露后的表達改變。結(jié)果顯示，子代大鼠海馬LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值在低劑量鉛暴露后與對照組相比無明顯變化，高劑量鉛暴露后呈顯著上調(diào)(P＜0.001，圖3)。

2.4 慢性鉛暴露下子代大鼠海馬腦區(qū)LAMP2表達變化 Western blot 結(jié)果顯示，在120 kDa可檢測到LAMP2 的條帶。子代大鼠在低劑量與高劑量鉛暴露后海馬自噬相關(guān)蛋白LAMP2表達量與對照組相比無明顯差異(P ＞0.05)。

圖3 子代大鼠慢性鉛暴露后海馬LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的表達變化Fig.3 Changes of LC3 levels in hippocampus following chronic lead exposure in rats

2.5 慢性鉛暴露下子代大鼠海馬腦區(qū)cathepsin B 表達變化 我們采用免疫熒光組織化學技術(shù)對cathepsin B 在海馬神經(jīng)元的表達定位進行研究。激光共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示，慢性鉛暴露高劑量組(d、e、f)較正常對照組(a、b、c)的cathepsin B 在海馬錐體神經(jīng)元的陽性表達明顯增加，推測慢性鉛暴露誘導了cathepsin B 在海馬神經(jīng)元的活性增加(圖4)。

3 討論

鉛對兒童腦智力發(fā)育及神經(jīng)行為的神經(jīng)毒性問題已經(jīng)受到世界各國學者的高度關(guān)注。作為具有典型神經(jīng)發(fā)育毒性的重金屬元素，鉛對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損害是不可逆的［7-8］。兒童作為特殊群體，與成人相比鉛更易透過血腦屏障。有研究表明，在相同條件下通過血腦屏障的鉛含量，兒童是成人的18 倍。鉛暴露的年齡越小，對鉛神經(jīng)毒性的易感性越高，血腦屏障阻止鉛進入腦內(nèi)的能力越差［9-10］。此外，據(jù)研究顯示鉛容易透過胎盤屏障，由母體轉(zhuǎn)運胎兒體內(nèi)，故胎兒的血鉛濃度與母體是一致的，鉛還可通過乳汁排泄，母體可通過哺乳將鉛傳遞給新生兒。由此可見，母體鉛污染對子代產(chǎn)生的影響不容忽視，更需關(guān)注的是兒童發(fā)育早期鉛暴露所產(chǎn)生的智力和神經(jīng)行為損害在停止鉛暴露后可能持續(xù)到成年階段［11-14］。本研究以慢性鉛暴露子代大鼠作為研究對象，以自噬/溶酶體信號途徑為切入點，系統(tǒng)研究鉛暴露對大鼠海馬腦區(qū)自噬相關(guān)蛋白的表達變化，為鉛暴露神經(jīng)毒性分子機制研究提供重要線索。本研究結(jié)果提示:慢性鉛暴露可誘導大鼠海馬腦區(qū)發(fā)生自噬/溶酶體途徑關(guān)聯(lián)信號蛋白表達變化，可能與海馬腦區(qū)鉛含量增加及神經(jīng)元損傷程度存在內(nèi)在關(guān)聯(lián)性。

圖4 免疫熒光組織化學觀察子代大鼠慢性鉛暴露后海馬錐體神經(jīng)元cathepsin B的表達變化Fig.4 Changes of cathepsin B immunofluorescence staining in hippocampus following chronic lead exposure in rats

大腦海馬區(qū)是處理學習、記憶及情感等高級認知功能的重要腦功能區(qū)域與信號整合交匯點，可介導神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)與功能的可塑性改變，也是多種外界損傷因素存在時的易損功能單元。本研究選定海馬腦區(qū)首先檢測了不同劑量慢性鉛暴露對海馬腦區(qū)鉛含量的影響?，F(xiàn)有的研究結(jié)果表明，慢性鉛暴露可損傷大鼠海馬CA1 區(qū)和DG 區(qū)的長時程增強(long-term potentiation，LTP)和長時程抑制(long-term depression，LTD)的誘導［15-17］。實際上，研究人員應用磁共振腦功能成像技術(shù)觀察了鉛影響兒童腦結(jié)構(gòu)和功能的變化，鉛中毒兒童的總智商顯著下降，鉛嚴重損傷了兒童腦內(nèi)海馬和前額兩個與智力發(fā)育相關(guān)的重要區(qū)域［18］。與慢性鉛暴露導致的血鉛含量增加相一致，我們的研究發(fā)現(xiàn)慢性鉛暴露直接導致海馬腦鉛含量增加，與慢性鉛暴露量呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系，確認了海馬腦區(qū)是子代大鼠慢性鉛暴露條件下的敏感區(qū)域。

自噬在神經(jīng)元損傷和修復過程發(fā)揮著雙重效應，本研究采用自噬/溶酶體途徑關(guān)聯(lián)蛋白標記物，側(cè)重于了解慢性鉛暴露條件下海馬腦區(qū)是否存在著自噬/溶酶體途徑的激活。有研究證實，細胞氧化應激損傷與自噬存在一定的關(guān)系，而眾多研究發(fā)現(xiàn)鉛暴露后易導致神經(jīng)細胞氧化損傷?；谶@樣的關(guān)系，我們通過Western blot 檢測慢性鉛暴露海馬腦區(qū)自噬相關(guān)蛋白Beclin 1、LC3 與LAMP2 的表達。Beclin 1 是自噬體的標志分子之一，大量研究表明Beclin1 不僅參與自噬體的形成，還可通過調(diào)節(jié)自噬活性對細胞的發(fā)生、發(fā)展起著重要作用。首先，本研究發(fā)現(xiàn)低劑量鉛暴露組導致大腦海馬區(qū)域Beclin 1 表達降低;相反，高劑量鉛暴露組Beclin 1 卻表現(xiàn)為表達上調(diào)，并沒有出現(xiàn)與暴露劑量關(guān)聯(lián)的量效關(guān)系的變化。值得關(guān)注的是，Beclin l 可能同時參與凋亡和自噬兩種程序性細胞死亡過程，有研究表明，凋亡抑制因子bcl-2 和Beclin l 相互作用平衡在兩種程序性細胞死亡轉(zhuǎn)換過程中起重要調(diào)節(jié)作用。Scherz-Shouval等［19］研究認為，活性氧(reactive oxygen species，ROS)是自噬激活的上游信號分子，其可以誘導Beclin 1 的表達增多。Beclin 1 進而通過與磷脂酰肌醇3 磷酸激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)形成復合物來參與募集胞漿蛋白質(zhì)用于自噬體膜的形成［20-21］，其是自噬體形成的早期過程所必需的，與自噬體形成的啟動有關(guān)。我們推測低劑量與高劑量鉛暴露組導致大腦海馬區(qū)域Beclin 1 表達的差異，與不同劑量鉛暴露導致海馬神經(jīng)元的損傷程度不同，所以導致產(chǎn)生的自噬反應強弱不同有關(guān)。

微管相關(guān)蛋白1 的輕鏈3(LC3)是自噬體膜標志性蛋白質(zhì)。LC3 在體內(nèi)同時以兩種不同分子量的形式存在，其中18 kDa 的LC3 蛋白是微管相關(guān)蛋白1 的輕鏈亞基，稱為LC3-Ⅰ;16 kDa 的LC3 蛋白則是自噬體膜的必須組分，稱為LC3-Ⅱ，定位于自噬前體和自噬體的內(nèi)外膜上［22-23］。本研究中，我們檢測了慢性鉛暴露后LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高劑量鉛暴露組導致大腦海馬區(qū)域LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值明顯增加，但低劑量鉛暴露組未見明顯變化。提示慢性高劑量鉛暴露導致胞漿可溶型LC3-Ⅰ向胞漿蛋白內(nèi)膜結(jié)合型LC3-Ⅱ的形式轉(zhuǎn)化。因為自噬發(fā)生時細胞內(nèi)LC3-Ⅱ含量會增加，同時LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ形式轉(zhuǎn)化也會明顯增多，所以通過監(jiān)測LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值可以了解自噬水平變化，比值升高說明慢性高劑量鉛暴露組細胞早期自噬水平增加［24-25］。

自噬過程可將胞質(zhì)中蛋白質(zhì)等大分子及生理或病理引起破損的細胞器，在單位膜包裹的囊泡中大量降解，并在溶酶體的參與下進行再循環(huán)利用［26］。自噬體可與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解其包裹的內(nèi)容物，實現(xiàn)細胞自身代謝及一些細胞器的更新。LAMP2 是一種高度糖基化的溶酶體膜內(nèi)蛋白，可能參與維持溶酶體膜的完整性以及作為一種轉(zhuǎn)運受體協(xié)助蛋白進入溶酶體［27］，其可以作為溶酶體的標記物［28］。當自噬溶酶體聚集會導致LAMP2 減少并具有相關(guān)性，LAMP2 可能對自噬機制有重要作用。但是，我們在慢性鉛暴露實驗大鼠模型中，未發(fā)現(xiàn)慢性鉛暴露可誘導LAMP2 的蛋白表達發(fā)生變化，這可能與我們所觀察的病程(60 d)和腦區(qū)相關(guān)。Cathepsin B 是溶酶體蛋白酶，屬于木瓜蛋白酶家族中的半胱氨酸蛋白水解酶，在正常情況下主要以酶原的形式存在于溶酶體內(nèi)發(fā)揮蛋白水解作用，大約只有10%的酶原可被生理性分泌至胞漿，然后可自身激活或被其它蛋白水解酶水解成活性形式，參與一些生理過程。而當受外界信號刺激的病理狀態(tài)下，由于細胞損傷導致溶酶體膜通透性增加或者破裂，大量cathepsin B 可滲透到胞漿激活參與降解細胞成分，造成進一步的細胞損害。當自噬體與溶酶體融合過程中，溶酶體內(nèi)cathepsin B 會釋放至胞漿而激活水解，因此cathepsin B 亦可以作為溶酶體的標記物，檢測胞漿cathepsin B 的表達可能對輔助判斷自噬溶酶體融合有一定的意義［28］。我們發(fā)現(xiàn)海馬腦區(qū)高劑量鉛暴露組cathepsin B 在海馬錐體神經(jīng)元的陽性染色明顯增加，推測慢性鉛暴露誘導了cathepsin B 在海馬神經(jīng)元的活性增加。在后續(xù)研究中有必要采用酶聯(lián)免疫吸附測定LAMP2、cathepsin B 活性或采用透射電鏡技術(shù)了解慢性鉛暴露后海馬腦區(qū)自噬/溶酶體的變化情況。

鑒于Beclin 1、LC3、LAMP2 及cathepsin B分別處于自噬/溶酶體信號途徑的不同環(huán)節(jié)，Beclin 1、LC3 反映早期自噬水平的變化［29-30］，而LAMP2 與cathepsin B 多反映溶酶體激活程度［28，31］。我們的研究表明，慢性鉛暴露后在海馬腦區(qū)自噬不同階段均出現(xiàn)變化，表明自噬/溶酶體途徑的穩(wěn)態(tài)失衡參與了慢性鉛神經(jīng)毒性的整個病理過程。有報道稱自噬水平增高可能是一種代償性的保護效應［32］。就本研究所涉及到的慢性鉛暴露模型而言，我們推測大鼠海馬腦區(qū)自噬水平的增高可能與代償性效應和神經(jīng)元損傷兩者均相關(guān)聯(lián)。在損傷早期或輕度損傷階段，自噬水平增高可能是一種代償性的保護效應，但在自噬超過某一閾值過度激活情況下卻會損傷細胞器并促發(fā)程序性細胞死亡。我們推測嚴重鉛毒性導致的自噬失代償可能由以下原因造成:損傷過程中氧化應激造成的自噬失能;各種途徑的酶作用底物使得自噬途徑超負荷，消耗了必要自噬體;受損的神經(jīng)元引起的溶酶體內(nèi)蛋白水解酶活性進行性下降。綜上所述，本研究表明了慢性鉛暴露模型對神經(jīng)細胞自噬/溶酶體相關(guān)蛋白表達會產(chǎn)生影響，從而可能導致神經(jīng)細胞自噬水平出現(xiàn)變化，并且不同劑量慢性鉛暴露會表現(xiàn)為不同的自噬/溶酶體反應，由此我們推測自噬/溶酶體信號轉(zhuǎn)導途徑可能參與了慢性鉛暴露致神經(jīng)毒性分子機制過程。繼續(xù)深入探討自噬/溶酶體信號轉(zhuǎn)導途徑改變與慢性鉛中毒導致的大腦病理改變及神經(jīng)癥狀發(fā)生機制有重要意義。后續(xù)研究進一步圍繞慢性鉛暴露后不同病理損傷時程的自噬形態(tài)學及敏感蛋白標志物的變化，不同病理損傷程度與自噬/溶酶體信號關(guān)聯(lián)性，不同功能腦區(qū)的自噬程度等多個層面開展。未來的研究也應該逐步注重自噬有關(guān)調(diào)控藥物聯(lián)合排鉛藥物等，用于慢性鉛中毒防治的臨床開發(fā)、應用。

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