劉洪一,李 榮,劉巨超,李 力,梁文濤,鐘 苑,徐迎新

(中國人民解放軍總醫(yī)院,1.腫瘤外科;2.普通外科研究所,北京,100853)

對于胃腸癌的治療,除手術(shù)、化療及放療等治療之外,生物治療尤其是應(yīng)用CIK細(xì)胞進(jìn)行腫瘤的過繼免疫治療是近年來研究較多的一種治療手段[1],并已廣泛應(yīng)用于臨床。但CIK細(xì)胞對于腫瘤的治療缺乏靶向性,CIK細(xì)胞很難在腫瘤周圍得到很好的濃聚。而目前有許多雙特異性抗體在體外實(shí)驗(yàn)取得了良好的結(jié)果,并且部分雙特異性抗體的研究已進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)階段[2],抗CD3抗CEA的雙特異性抗體就是其中研究較多的抗體之一[3],它一方面可以激活細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞,另一方面可以使免疫細(xì)胞在腫瘤局部聚集,更好地殺傷腫瘤細(xì)胞。本研究在前人研究的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步探討了抗CD3抗CEA雙特異性單鏈抗體介導(dǎo)的CIK細(xì)胞對胃腸癌的體內(nèi)殺傷作用,現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

抗CD3抗CEA雙特異性單鏈抗體(BsAb)購自北京安渡符基因工程技術(shù)有限公司;人胃低分化腺癌BGC823細(xì)胞、人結(jié)腸中分化腺癌SW1116細(xì)胞,由本院普通外科研究所提供。健康人外周血由本院輸血科提供,近期無感染病史及疫苗接種病史,乙肝、丙肝、梅毒、AIDS檢測陰性。裸小鼠50只,購自本院實(shí)驗(yàn)動物中心,均為雌性,鼠齡6周,體質(zhì)量17～20 g。于本院實(shí)驗(yàn)動物中心SPF級無菌飼養(yǎng)。其他常規(guī)試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純化。

1.2 CIK細(xì)胞的制備與鑒定

取人外周血25 mL與生理鹽水等體積混勻,然后緩慢的鋪在等體積的分離液上,以2000 r/min離心,20 min;收集白膜層,用生理鹽水洗滌1～2次,2500 r/min離心,10 min;3 h后收集未貼壁PBMC細(xì)胞,用KBM-551培養(yǎng)基10 mL重懸,移至75 cm2T型培養(yǎng)瓶中;0時刻加入rh-IFN-r 1000 U/mL終濃度;37℃,5%CO2,飽和濕度培養(yǎng)過夜;加入 CD3McAb 2 μg/mL終濃度,IL-2500 U/mL終濃度;隔日加入新鮮培養(yǎng)基、IL-2;培養(yǎng)過程中經(jīng)常觀察細(xì)胞狀態(tài)以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)用。在CIK細(xì)胞培養(yǎng)成熟后,應(yīng)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行CD3、CD4、CD8和CD56表達(dá)的鑒定。

1.3 動物模型的建立

利用T細(xì)胞免疫缺陷裸鼠,分別以人胃低分化腺癌BGC823細(xì)胞及人結(jié)腸中分化腺癌SW1116細(xì)胞制備小鼠皮下荷瘤模型。分別取對數(shù)生長期上述細(xì)胞,0.25%胰酶消化后制成單細(xì)胞懸液,胎盤藍(lán)實(shí)驗(yàn)證實(shí)細(xì)胞活力≥95%;用6號針頭注射器抽取0.2 mL瘤細(xì)胞懸液(含活細(xì)胞5×106個)接種于裸鼠左腋下皮下,無菌環(huán)境下飼養(yǎng);致瘤2周后,腫瘤生長約6 mm,剔除腫瘤過大、過小或棘突明顯的裸鼠。

1.4 體內(nèi)抑瘤試驗(yàn)

胃癌及結(jié)腸癌組分別隨機(jī)分成3組。對照組(n=5),尾靜脈注射生理鹽水0.2 mL/只,1次/3 d;CIK組(n=5),尾靜脈注射單純?nèi)薈IK細(xì)胞0.2 mL/只(培養(yǎng)14 d左右,含活細(xì)胞 1×107個),1次/3 d;CIK+雙抗組(n=5),尾靜脈注射人CIK細(xì)胞和抗CEA抗CD3雙特異性單鏈抗體(1×107個CIK 細(xì)胞與10 μg抗體預(yù)混合30 min后洗脫),1次/3 d;連續(xù)治療 6次;每 3 d以游標(biāo)卡尺測量腫瘤最大徑(a)和最小徑(b),按公式計算腫瘤體積:V=ab2/2;治療6次后,觀察3 d處死裸鼠,取出腫瘤組織稱重。計算公式抑瘤率:抑瘤率=(對照組瘤重-實(shí)驗(yàn)組瘤重)/對照組瘤重×100%。

圖1 流式細(xì)胞結(jié)果

2 結(jié) 果

2.1 流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果

FMC結(jié)果顯示:PBMC細(xì)胞經(jīng)過10 d左右的培養(yǎng)后,CD3、CD4、CD8和 CD56的表達(dá)率分別為95.78%、29.36%、72.82%和53.32%,確定為CIK細(xì)胞[4],見圖1。

2.2 裸鼠動物模型

利用T細(xì)胞免疫缺陷裸鼠,以人胃低分化腺癌BGC823細(xì)胞及人結(jié)腸中分化腺癌SW1116細(xì)胞分別制備裸鼠皮下荷瘤模型。腫瘤懸液注射于裸鼠左側(cè)腋下2周后,可觀察到腫瘤生長,游標(biāo)卡尺測量最大直徑為0.5～0.6 cm,成瘤率100%。

2.3 抑瘤實(shí)驗(yàn)

胃癌及結(jié)腸癌的對照組腫瘤體積均持續(xù)增大,CIK組腫瘤體積均增長緩慢,2組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01);CIK+雙抗組腫瘤生長均明顯受到抑制,與對照組及CIK組之間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01),見圖2、圖3。治療后3 d將裸鼠頸椎脫臼處死,剝離腫瘤塊、稱重,計算腫瘤抑瘤率,見表 1、表2;CIK組和CIK+雙抗組均可抑制腫瘤生長,胃癌的抑瘤率分別為29.90%和44.33%,瘤體積和瘤重和對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01);結(jié)腸癌的抑瘤率分別為14.93%和38.81%,瘤體積和瘤重和對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。CIK組和CIK+雙抗組比較,胃癌及結(jié)腸癌的瘤體積、瘤重間的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。表明CIK細(xì)胞本身可以抑制腫瘤細(xì)胞的生長,在加入抗CD3抗CEA雙特異性單鏈抗體后抑瘤作用明顯增強(qiáng)。

表1 胃癌治療18 d后3組小鼠抑腫率比較()

表1 胃癌治療18 d后3組小鼠抑腫率比較()

與對照組比較,＊P<0.05,＊＊P<0.01;與CIK組比較,#P<0.05

組別 n 瘤體積(cm3) 瘤重(g) 抑瘤率(%)對照組 5 0.88±0.14 0.97±0.16 -CIK組 5 0.64±0.12＊ 0.68±0.08＊＊ 29.90 CIK+雙抗組 5 0.42±0.09＊＊# 0.54±0.05＊＊# 44.33

表2 結(jié)腸癌治療18 d后3組小鼠抑腫率比較()

表2 結(jié)腸癌治療18 d后3組小鼠抑腫率比較()

與對照組比較,＊＊P<0.01;與CIK組比較,#P<0.05,##P<0.01

組別 n 瘤體積(cm3) 瘤重(g) 抑瘤率(%)對照組 5 0.74±0.09 0.67±0.15 -CIK組 5 0.56±0.07＊＊ 0.57±0.09 14.93 CIK+雙抗組 5 0.39±0.06＊＊## 0.41±0.08＊＊# 38.81

圖2 胃癌腫瘤生長曲線

圖3 結(jié)腸癌腫瘤生長曲線

3 討 論

據(jù)2002年世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計,中國人胃癌的總?cè)藬?shù)占全世界的40%以上,而且胃癌相關(guān)死亡率處于第2位,僅次于肺癌[5]。2007年,全球結(jié)直腸癌新病例接近120萬,死亡63萬[6],據(jù)我國統(tǒng)計資料估計,我國2005年結(jié)直腸癌發(fā)病數(shù)和死亡數(shù)分別達(dá)17.2萬和9.9萬,已超過美國[7]。對于胃腸癌經(jīng)傳統(tǒng)的手術(shù)、化療及放療等治療后,5年生存率仍不理想。因此,探索新的、有效的胃癌治療方法勢在必行。過繼性細(xì)胞免疫治療(ACI)是通過輸注免疫活性細(xì)胞增強(qiáng)腫瘤患者的免疫功能達(dá)到抗腫瘤的效果。其中以細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(CIK細(xì)胞)目前應(yīng)用較為廣泛[8]。CIK細(xì)胞作為腫瘤過繼免疫治療的一個新型免疫活性細(xì)胞,是近年來研究較多的一種生物治療手段。但是,研究同時發(fā)現(xiàn)CIK細(xì)胞在體外實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出的殺傷腫瘤細(xì)胞的活性,應(yīng)用于體內(nèi)效果卻往往差強(qiáng)人意。因此,如何使CIK細(xì)胞在體內(nèi)識別并到達(dá)靶細(xì)胞,從而發(fā)揮殺傷作用,是迫切需要解決的問題,也是提高腫瘤生物治療療效的關(guān)鍵。

目前惡性腫瘤的靶向治療備受矚目,已有大量的靶向藥物應(yīng)用于臨床。而目前的靶向藥物大都以腫瘤細(xì)胞特異性抗原為靶抗原,直接作用于靶點(diǎn),抑制腫瘤的生長或者阻斷細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路[9]。因此要求靶抗原除了具有腫瘤組織特異性之外,還要求靶抗原在腫瘤的生長環(huán)節(jié)中具有重要地位。而已知的大多數(shù)腫瘤特異性抗原均不具有這樣的組織特異性,因此靶向藥物的研制也受到巨大的阻礙[10]?？杉せ罴?xì)胞毒T淋巴細(xì)胞并使其在腫瘤局部聚集的抗CD3抗腫瘤特異性抗原的雙特異性抗體備受研究者矚目。

為了觀察雙特異性單鏈抗體介導(dǎo)的CIK細(xì)胞對胃癌的體內(nèi)殺傷作用,本研究制備人源胃癌及結(jié)腸癌的荷瘤裸鼠模型。本研究結(jié)果顯示,對照組腫瘤體積持續(xù)增大,CIK組腫瘤體積增長緩慢,CIK+雙抗組腫瘤生長明顯受到抑制。CIK細(xì)胞本身可以抑制腫瘤細(xì)胞的生長,在加入抗CD3抗CEA雙特異性單鏈抗體后抑瘤作用明顯增強(qiáng)。其原因可能是CIK細(xì)胞結(jié)合了雙特異性抗體后,具有更好的腫瘤靶向作用。同時,雙特異性抗體除了可以結(jié)合CIK細(xì)胞外,還可以結(jié)合任何表達(dá)CD3的免疫細(xì)胞,因此在具有正常免疫系統(tǒng)的體內(nèi)試驗(yàn)時,可能會收到意想不到的良好效果,但結(jié)果有待于進(jìn)一步研究。

[1]Baeuerle P A,Reinhardt C.Bispecific T-cell engaging antibodies for cancer therapy[J].Cancer Res,2009,69(12):4941.

[2]Compte M,Blanco B,Serrano F,et al.Inhibition of tumor growth in vivo by in situ secretion of bispecific anti-CEA x anti-CD3diabodies from lentivirally transduced human lymphocytes[J].Cancer Gene Ther,2007,14(4):380.

[3]Brown D M,Kamperschroer C,Dilzer AM,et al.IL-2 and antigen dose differentially regulate perforin-and FasL-mediated cytolytic activity in antigen specific CD4+Tcells[J].Cell Immunol,2009,257(1-2):69.

[4]Parkin DM,Bray F,Ferlay J,et al.Global cancer statistics,2002[J].CA Cancer J Clin,2005,55(2):74.

[5]McMichael A J.Food,nutrition,physical activity and cancer prevention.Authoritative report from World Cancer Research Fund provides global update[J].Public Health Nutr,2008,11(7):762.

[6]Searle B,Chan D.American Society of Clinical Oncology--42nd annual meeting.Ovarian cancer,solid tumors,neuroendocrine tumors and lymphoma.2-6 June 2006,Atlanta,GA,USA[J].IDrugs.2006,9(8):529.

[7]楊 玲,李連弟,陳育德,等.中國2000年及2005年惡性腫瘤發(fā)病死亡的估計與預(yù)測[J].中國衛(wèi)生統(tǒng)計,2005,22:218.

[8]Weng D S,Zhou J,Zhou Q M,et al.Minimally invasive treatment combined with cytokine-induced killer cells therapy lower the short-term recurrence rates of hepatocellular carcinomas[J].Immunother,2008,31:63.

[9]黃宇賢,郭坤元.腫瘤生物治療的新模式:分子靶向-過繼性細(xì)胞免疫治療[J].中國腫瘤生物治療雜志,2010,17(3):243.

[10]馬 全,武正炎,查小明,等.Mage-A3抗原肽負(fù)載DC過繼免疫治療乳腺癌的實(shí)驗(yàn)研究[J].實(shí)用臨床醫(yī)藥雜志,2006,10(3):2.