陳學國，賴永權，蔡宗葦

(1. 中國刑事警察學院法醫(yī)系，遼寧 沈陽 110854; 2. 香港浸會大學化學系，香港特別行政區(qū) 999077)

2011-07-15；

2011-10-11

香港浸會大學項目(FRG/08-09/II-01)資助

陳學國(1977～)，男(漢)，副教授，從事毒物、毒品分析。E-mail:chenxg@dicp.ac.cn

蔡宗葦(1962～)，男(漢)，教授，從事藥物、環(huán)境污染物分析。E-mail:zwcai@hkbu.edu.hk

液相色譜-電噴霧離子阱質譜分析烏頭堿及其代謝物

陳學國1，2，賴永權2，蔡宗葦2

(1. 中國刑事警察學院法醫(yī)系，遼寧 沈陽 110854; 2. 香港浸會大學化學系，香港特別行政區(qū) 999077)

為了研究烏頭堿的生物轉化規(guī)律，建立了烏頭堿及其代謝物分離與鑒定的液相色譜-電噴霧離子阱質譜(LC-ESI-ITMS)方法。首先利用體外代謝法得到大鼠肝微粒體S9組分中烏頭堿及代謝產物混合體系，然后利用LC-ESI-ITMS聯(lián)用技術對各代謝物進行分析，得到烏頭堿代謝物的[M+H]+分子質量信息，進一步結合多級串聯(lián)質譜(LC/MSn)分析結果獲得結構信息，對代謝物進行鑒定，從而推測代謝物結構，并結合大鼠尿中烏頭堿及其代謝物的分析結果，得到烏頭堿的生物轉化規(guī)律。本方法在大鼠肝微粒體S9組分中鑒定得到8種體外代謝產物。

液相色譜-電噴霧離子阱質譜；肝微粒體；烏頭堿；代謝

肝臟是生物體藥物代謝的主要器官，研究藥物的肝臟代謝對于研究藥物體內代謝非常重要[1]。作為研究藥物代謝的經典方法，體外肝臟代謝不僅可以排除體內因素的干擾，還可以直接觀察酶對底物的選擇性代謝，為藥物的整體試驗提供可靠的理論依據，尤其是對于那些體內代謝轉化率低、毒性大、缺乏靈敏檢測手段的藥物來說，體外肝臟代謝研究已經成為行之有效的研究手段[2]。

作為藥物分析領域最強有力的分析檢測技術，液相色譜-質譜(LC/MS)聯(lián)用技術已經在環(huán)境分析、生化分析、藥物分析等領域得到廣泛應用[3]，并顯示出靈敏度高、專屬性好、樣品處理簡單等優(yōu)越性。離子阱質譜(ITMS)不僅可以給出樣品分子質量的相關信息，而且還可以給出有關樣品結構的豐富信息[4]。由于具有靈敏度高、選擇性好等特點，液相色譜-電噴霧離子阱質譜(LC-ESI-ITMS)聯(lián)用已經成為藥物代謝研究的有力工具和代謝物結構分析的重要方法[5]?；贚C-ESI-ITMS技術，已經建立了藥物及其代謝物快速高通量分析方法，并成功用于多種藥物及其代謝產物的分離與鑒定[6-7]。

毛莨科烏頭屬植物是我國著名的傳統(tǒng)中藥，具有祛風除濕、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤等功效，廣泛用于治療風濕麻痹、關節(jié)疼痛、心腹冷痛等疾病，烏頭堿是該類植物的主要活性成分，也是含量最高、毒性最大的成分[8]。烏頭堿為C19雙酯二萜類生物堿，具有較強的毒性，人口服0.2 mg即可中毒，臨床應用該藥物時極其慎重，一旦使用不當即可導致中毒，嚴重者可能危及生命，由于使用不當而造成中毒甚者致死的情況時有發(fā)生[9]。因此，研究烏頭堿及其代謝產物，明確生物轉化規(guī)律，對于該類藥物的臨床使用和中毒檢驗等具有重要意義。針對不同檢材中的各種烏頭生物堿及其代謝物，國內外學者已經建立了多種樣品處理方法和檢測技術，氣相色譜-質譜聯(lián)用法[10]、液相色譜法[11]、液相色譜-質譜聯(lián)用法[12]、毛細管電泳[13]等也被廣泛用于烏頭生物堿分析，并已經成為烏頭生物堿及其代謝物檢測的主要方法。生物體內代謝后，烏頭堿主要通過脫乙酸基、脫苯甲?；?、脫甲基和酯化反應等，得到烏頭次堿、烏頭原堿、去甲基烏頭堿、去雙甲基烏頭堿、去乙基烏頭堿等單酯型、雙酯型和脂類代謝產物[14]。另外，結合體外代謝研究方法，在烏頭堿代謝產物中也檢測到去氫烏頭堿、去氧烏頭堿等代謝產物[15]。

本研究建立了烏頭堿及其代謝物分離與鑒定的LC-ESI-ITMS方法。該方法利用體外代謝方法得到大鼠肝微粒體S9組分中烏頭堿及代謝產物混合體系，然后借助LC-ESI-ITMS法對各代謝物進行分析，得到烏頭堿代謝物的分子質量信息，進一步結合多級串聯(lián)質譜(LC/MSn)獲得結構信息，對其代謝物進行鑒定。

1 實驗部分

1.1儀器與實驗條件

1.1.1色譜條件 液相色譜-電噴霧離子阱質譜系統(tǒng)由HP 1100液相色譜儀(Hewlett-Packard，Wilmington，DE，USA)和Esquire 4000離子阱質譜儀(Bruker-Fransen，Bremen，Germany)組成；色譜柱：Waters Symmetry C18柱(150×2.1 mm，3.5 μm)；流動相A為0.1 mM乙酸銨-甲酸緩沖溶液(pH 4.5)，流動相B為乙腈-0.1 mM乙酸銨-甲酸緩沖溶液)(V(乙腈)∶V(0.1 mM乙酸銨-甲酸緩沖溶液)=90∶10，pH 4.5)，流速為0.20 mL/min，起始梯度為5%B，在20 min內線性增加至90%B，維持5 min，進樣量為5 μL。

1.1.2質譜條件 電噴霧離子化源(ESI)，正離子方式檢測，全離子掃描模式，掃描范圍為m/z50～1 000；電噴霧氣(N2)溫度為350 ℃,流量為8.0 L/min；源內碰撞誘導解離氣為氦氣；MSn通過利用總離子流控制單元(ICC)自動調整積分時間實現(xiàn)。

1.2試劑與動物

乙腈(色譜純)：美國Tedia(Fairfield, OH)公司產品；甲酸、乙酸銨、磷酸二氫鉀(分析純)：Mallinckrodt(Paris, KY, USA)公司產品；烏頭堿標準品(純度>99.9%)、二甲亞砜(DMSO，純度>99.9%)、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸(NADPH)：美國Sigma公司(St. Louis, USA)產品；純水經Milli-Q水處理系統(tǒng)(Millipore, USA)純化。雄性SD大鼠購自香港中文大學實驗動物中心。

1.3肝微粒體S9組分的制備

SD大鼠斷頭處死后，放血，以冰冷生理鹽水由肝門靜脈沖洗肝，去除肝中殘余血液，取出肝臟，稱重，用預先冷凍的0.10 mol/LKCl-PBS緩沖溶液(pH 7.4)洗凈，剪碎，制成肝勻漿(1 g肝/5 mL KCl-PBS緩沖溶液)，以9 000 r/min于4 ℃離心10 min，棄去上層脂質和下層沉淀物后的上清液即為大鼠肝微粒體S9組分。大鼠肝微粒體S9組分中蛋白質和細胞色素P450含量分別用Bradford法和Omura法測定，分別為10.34 g/L和0.05 nmol/L。

1.4體外代謝與樣品處理過程

“這件事太復雜了，不能簡單去理解。S想一勞永逸地解決問題。但這兩個女人都給了他共同的感受，那就是壓抑、沖突和痛苦。S遇到Y時，對命運感激不已。他羞怯內向，恐懼于跟人打交道，他不是一個愛追逐女人的人，那是迫不得已。世上若有一個女人能使他平靜，那就是Y。他終于跟Y在一起了，卻依然沒法安寧。或者說，Y正在變得枯竭及死寂，S眼前浮現(xiàn)了一句唐詩：千山鳥飛絕，萬徑人蹤滅。Y猶如一顆正在塌縮的星球。當然，他們仍會睡覺，有時還是Y主動邀請。但S知道這是怎么回事。這連跟曲做愛都不如。”

將烏頭堿標準品用DMSO配制成濃度為2 mmol/L標準溶液，取5 μL標準溶液置于試管中，加入495 μL 0.1 mol/L KCl-PBS緩沖溶液(pH 7.4)，再加入適量NADPH，使NADPH濃度為3 mM，混勻后置于37 ℃水浴中預孵育5 min，然后，加入500 μL蛋白質濃度為2.0 g/L肝微粒體S9組分KCl-PBS緩沖溶液，得到烏頭堿孵育體系，其中烏頭堿、NADPH和肝微粒體蛋白質濃度分別為10 μmol/L、1.5 mmol/L和1.0 g/L。然后，置于37 ℃水浴中孵育0 min和60 min后，分別取50 μL孵育混合溶液，加入150 μL乙腈，混勻后置于冰浴中5 min，終止反應。最后，以14 000 r/min離心5 min后取上清液，氮氣吹干后，加入100 μLV(乙腈)∶V(水)=80∶20的溶液溶解，供LC/MS測定。

1.5尿樣收集與處理

將5只雄性SD大鼠，體重為(590±5) g，置于代謝籠中，禁食12 h，收集尿樣作為空白對照尿樣，然后，將烏頭堿標準品按照0.2 mg/kg劑量灌胃給藥，收集所有大鼠0～24 h尿樣，置于-20 ℃冷凍保存。

取解凍后的1.0 mL尿樣，冷凍干燥后，加入0.5 mLV(乙腈)∶V(水)=80∶20的溶液溶解，以14 000 r/min離心5 min后取上清液，供LC/MS測定。

2 結果與討論

根據文獻報道[12]，本研究首先以烏頭堿為研究對象，考察烏頭堿的色譜行為和質譜響應值，優(yōu)化烏頭堿及其代謝物分析的LC-ITMS分析色譜、質譜條件，烏頭堿在優(yōu)化實驗條件下分析得到的LC-ITMS譜圖，示于圖1。

圖1 優(yōu)化實驗條件下烏頭堿的LC-ITMS譜圖Fig.1 LC-ITMS spectra of Aconitine

在優(yōu)化實驗條件下，對烏頭堿及其體外代謝產物混合體系進行LC-ITMS全離子掃描模式分析，得到LC-ITMS譜圖。根據藥物在肝微粒體中的代謝規(guī)律[16]，結合LC-ITMS譜圖，通過比較烏頭堿在大鼠肝微粒體S9組分中孵育60 min和0 min后的LC-ITMS譜圖，根據[M+H]+分子質量信息，初步鑒定出8種代謝產物。烏頭堿及8種體外代謝產物的LC-ITMS譜圖示于圖2，相應的色譜保留時間和[M+H]+分子質量信息列于表1。

利用LC-ITMS全掃描模式對烏頭堿及其代謝產物進行初步鑒定，只能根據所測到的[M+H]+離子質量信息得到，為了進一步確定代謝物的結構，可以借助LC/MSn進行深入分析，結合準分子離子、二級串聯(lián)質譜和三級串聯(lián)質譜分子碎片離子峰，最終確定其結構。利用多級串聯(lián)質譜法分析初步鑒定出的烏頭堿及8種代謝產物，結合相關文獻報道，進一步確定了烏頭堿和8種代謝產物的結構，相應的質譜數(shù)據列于表1和圖3～10。

保留時間為19.3 min的化合物M0，其準分子離子m/z646.2，與烏頭堿的質子化分子[M+H]+一致，如圖1所示，二級串聯(lián)質譜(MS/MS)中基峰離子m/z586.2，三級串聯(lián)質譜(MS3)基峰離子m/z526.2與烏頭堿標準品的色譜保留時間及各級質譜行為相同，鑒定其為烏頭堿。

圖2 優(yōu)化條件下烏頭堿及其體外代謝產物LC-ITMS譜圖Fig.2 LC-ITMS spectrum of Aconitine and its metabolites

表1 烏頭堿及其8種代謝物的保留時間和分子質量信息 Table 1 Retention time and mass spectra of Aconitine and its metabolites

如圖3所示，化合物M1的色譜保留時間為14.0 min，準分子離子m/z604.2，相對于烏頭堿在相同條件下所得到的基峰離子減少42 u，說明二者具有相同的骨架結構，已有文獻報道[17]，42 u的中性丟失為脫去乙酰基造成的，在軟電離條件下檢測到m/z554.1和m/z522.1的碎片離子分別為二級和三級串聯(lián)質譜的基峰離子，推斷該化合物為烏頭堿結構中醋酸酯水解形成的烏頭次堿，該鑒定結果與文獻中報道關于烏頭次堿的質譜行為相符?；衔颩3色譜保留時間為16.2 min，準分子離子m/z586.2，相對于烏頭堿的基峰離子減少了60 u，軟電離條件下經過二級串聯(lián)質譜分析，得到基峰碎片離子[M+H-32]+(m/z554.1)，三級串聯(lián)質譜分析，得到主要碎片離子[M+H-32-32]+(m/z522.1)，示于圖4，結合魏巍等[18]在烏頭堿水解產物中檢測到焦烏頭堿[M+H]+分子離子峰m/z586.7的報道，推測M3為焦烏頭堿。

化合物M2和M4的準分子離子m/z相同，均為618.2，而且在該軟電離條件下二級質譜碎片也相同，均為m/z558.1，相對于烏頭堿在相同條件下所得的基峰離子分別減少28 u，但是，三級質譜碎片有差別，分別為m/z476.1和m/z498.1，而且色譜保留時間也不同，分別為14.9 min和16.9 min，示于圖5和圖6。由此可以判斷M2和M4為同分異構體，推測為烏頭堿脫去N-乙基或者O-雙甲基的產物，參考文獻報道[17]，根據相應的二級和三級質譜碎片，鑒定M2為N-去乙基烏頭堿，M4為O-去雙甲基烏頭堿。

色譜保留時間為17.0 min的M5，準分子離子m/z662.2，二級和三級質譜碎片分別為m/z602.1和m/z542.1，示于圖7，均比烏頭堿的基峰離子、二級質譜和三級質譜碎片多了16 u，這說明M5和烏頭堿具有相似的結構，中性丟失16 u推測為羥基，推斷其為烏頭堿的羥基化產物，參考文獻報道[19]，M5鑒定為羥基烏頭堿。

化合物M6色譜保留時間為17.8 min，準分子離子m/z632.1，比烏頭堿的基峰離子少14 u，14 u的中性丟失可能為亞甲基，另外，二級和三級質譜碎片分別為m/z572.1和m/z512.1，比較烏頭堿在同樣條件下所得的基峰離子均相差14 u，說明兩者具有相同的斷裂規(guī)律，因此推斷M6與烏頭堿結構相似，文獻[20]中報道了烏頭堿在體內代謝過程中可以丟失C-16位甲氧基中的亞甲基而形成C-16位羥基，產生16-O-去甲基烏頭堿，化合物M6其各級質譜的數(shù)據與文獻報道的16-O-去甲基烏頭堿裂解規(guī)律相同，示于圖8，故鑒定其為16-O-去甲基烏頭堿。

圖3 烏頭次堿的MSn譜圖Fig.3 Mass spectra of M1

圖4 N-去乙基烏頭堿的MSn譜圖Fig.4 Mass spectra of M2

圖5 焦烏頭堿的MSn譜圖Fig.5 Mass spectra of M3

圖6 O-去雙甲基烏頭堿的MSn譜圖Fig.6 Mass spectra of M4

圖7 羥基烏頭堿的MSn譜圖Fig.7 Mass spectra of M5

圖8 16-O-去甲基烏頭堿的MSn譜圖Fig.8 Mass spectra of M6

圖9 去氫烏頭堿的MSn譜圖Fig.9 Mass spectra of M7

圖10 去氧烏頭堿的MSn譜圖Fig.10 Mass spectra of M8

圖11 烏頭堿及其代謝物生物轉化過程Fig.11 Biotransformation of Aconitine and its metabolites

準分子離子m/z為644.2，色譜保留時間為18.8 min的化合物M7，比烏頭堿基峰離子僅少2 u，推測為烏頭堿脫去兩個氫的產物，參考文獻報道[17]，鑒定為去氫烏頭堿，二級和三級串聯(lián)質譜碎片分別為m/z584.2和m/z552.1，示于圖9。

化合物M8的色譜保留時間為20.3 min，分子離子、二級和三級串聯(lián)質譜碎片分別為m/z630.2、570.2、510.2，示于圖10，均比烏頭堿相應分子離子少16 u，由此推斷16 u的中性丟失為氧，參考文獻報道[21]，推斷M8為去氧烏頭堿。

為了更準確的鑒定烏頭堿在大鼠肝微粒體S9組分中的體外代謝產物，大鼠給藥后尿樣處理后經LC-ITMS分析，對照空白尿樣實驗結果，結合LC/MSn譜圖，烏頭堿原藥及8種體外代謝產物均被檢測到，除此以外，還檢測到更多的代謝產物。

根據鑒定出來的代謝產物結構，可以推斷烏頭堿及其代謝產物之間的生物轉化規(guī)律，對烏頭生物堿中毒的法醫(yī)鑒定、臨床診斷以及毒代動力學、毒理學研究等具有一定的指導意義。烏頭堿及8種代謝產物之間可能的生物轉化過程示于圖11。

另外，與體內代謝研究相比，體外代謝具有反應干擾小、操作簡單、代謝條件易于控制等優(yōu)點；同時，體外代謝可以實現(xiàn)在較短時間內得到大量代謝產物，便于對它們進行提取、分離、純化和表征；還能迅速有效的解決藥物代謝中的關鍵問題，例如代謝物結構鑒定、代謝途徑推斷等。因此，本研究利用LC-ITMS方法對烏頭堿及其代謝物進行分析結果為新藥開發(fā)、藥物毒代動力學、藥效學、毒理學等研究提供了一定的參考和借鑒。

3 結論

利用體外代謝方法，結合LC-ITMS聯(lián)用技術，建立了烏頭堿及其體外代謝產物的分析方法。該方法首先利用體外代謝方法得到大鼠肝微粒體S9組分中烏頭堿及代謝產物混合體系，然后利用LC-ESI-ITMS聯(lián)用技術對各代謝物進行分析，得到烏頭堿代謝物的[M+H]+分子質量信息，進一步結合多級串聯(lián)質譜(LC/MSn)分析結果獲得結構信息，對代謝物進行鑒定，從而推測代謝物結構，進而結合大鼠尿中烏頭堿及其代謝物的分析結果，得到烏頭堿的生物轉化規(guī)律。實驗結果表明：采用體外代謝方法，利用LC-ITMS聯(lián)用技術可以實現(xiàn)烏頭堿及主要代謝產物的同時檢測和分析，結合文獻報道與體內代謝過程，借助LC/MSn方法可以對代謝物的結構進行鑒定，并得到烏頭堿的生物轉化規(guī)律。本實驗結果對烏頭生物堿的法醫(yī)鑒定和臨床診斷具有一定的指導意義。

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SimultaneousAnalysisofAconitineandItsMetabolitesbyLiquidChromatography-ElectrosprayIonTrapMassSpectrometry

CHEN Xue-guo1, 2, LAI Yong-quan2, CAI Zong-wei2

(1.DepartmentofForensicMedicine,ChinaCriminalPoliceUniversity,Shenyang110854,China;2.DepartmentofChemistry,HongKongBaptistUniversity,HongKongSAR999077,China)

A method applying liquid chromatography-electrospray ionization-ion trap mass spectrometry (LC-ESI-ITMS) for the simultaneous analysis of Aconitine and its in-vitro metabolites is described. Aconitine was incubated with mouse liver microsome S9fraction firstly, and then the incubation sample was analyzed by LC-ESI-ITMS in full-scan mode. Aconitine and its metabolites were identified from the determination of molecular ions. The metabolites detection were confirmed from tandem mass spectrometry (MSn) analysis. Comparing with the analysis of urine, 8 metabolites were identified in the mouse liver S9fractions by comparing with the analysis of urine of rat oral with Aconitine and referring to the literature reports.

liquid chromatography-electrospray ion trap mass spectrometry; mouse liver S9fractions; Aconitine; in-vitro metabolism

O 657.63

A

1004-2997(2012)03-0065-09