鄭 倩， 劉 紅△， 劉 華， 曹弟勇， 蘭海濤

(川北醫(yī)學院 1生理教研室，2藥理教研室，四川 南充 637007)

1000-4718(2012)04-0733-05

2011-05-06

2011-11-07

四川省教育廳重點項目資助(No.08ZA165)；南充市科技支撐項目資助(No.2010SF09)

△通訊作者 Tel: 0817- 3352020 ;E-mail：lhtr1682002@yahoo.com.cn

果糖二磷酸鈉對2型糖尿病大鼠胰島內(nèi)質網(wǎng)應激時CHOP和JNK表達及胰島細胞凋亡的影響*

鄭 倩1， 劉 紅1△， 劉 華1， 曹弟勇2， 蘭海濤1

(川北醫(yī)學院1生理教研室，2藥理教研室，四川 南充 637007)

目的探討果糖二磷酸鈉(FDP)是否通過減輕內(nèi)質網(wǎng)應激蛋白CHOP和c-Jun氨基端激酶(JNK)的表達，減少2型糖尿病大鼠胰島細胞凋亡的發(fā)生。方法采用高脂飼養(yǎng)+小劑量鏈脲佐菌素制備2型糖尿病大鼠模型,成模后隨機分為FDP低劑量組(FDP1組)、FDP高劑量組(FDP2組)和模型組(MOD組),另設正常組(NOR組),治療組予相應藥物干預8周。比較各組大鼠空腹血糖(FBG)、空腹胰島素水平(Fins)和胰島素敏感指數(shù)(ISI)以觀察藥物對大鼠糖代謝的影響。采用TUNEL方法測定胰島細胞的凋亡情況，免疫組化檢測胰島CHOP和JNK應激蛋白的表達水平。結果與NOR組比較,MOD組大鼠FBG、FINS 明顯升高, ISI顯著降低(P<0.01)；與MOD組比較，F(xiàn)DP干預后，F(xiàn)DP2組大鼠FBG、FINS水平顯著降低，ISI顯著升高(P<0.01)；FDP1組大鼠FBG、FINS顯著降低(P<0.01)。與FDP1組比較，F(xiàn)DP2組大鼠FBG與FINS均顯著降低(P<0.01)，ISI顯著升高(P<0.01)。比較各組凋亡變化結果，MOD組較NOR組顯著升高(P<0.05)，F(xiàn)DP干預組較MOD組均明顯下降(P<0.01)，而且與FDP1組比較，F(xiàn)DP2組大鼠凋亡率降低(P<0.01)。比較各組大鼠胰島應激標志物JNK、CHOP的表達水平,MOD組較NOR組明顯升高(P<0.01),FDP組較MOD組均明顯下降(P<0.01)，與FDP1組相比，F(xiàn)DP2組CHOP、JNK的表達明顯降低，差異顯著(P<0.05)。結論FDP能減輕2型糖尿病大鼠胰島細胞凋亡的發(fā)生，保護胰島細胞功能，其機制可能與抑制胰島內(nèi)質網(wǎng)應激水平,降低CHOP、JNK的表達有關，并且FDP的保護作用具有劑量依賴性。

果糖二磷酸鈉； 糖尿病； 細胞凋亡; 內(nèi)質網(wǎng)應激； 胰島細胞

糖尿病( diabetes mellitus, DM)是一種嚴重威脅人類健康的常見病和多發(fā)病,糖尿病患者中90%以上為2型糖尿病。胰島細胞功能缺陷是2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)的主要病因之一，多種因素可以引起胰島細胞損傷，大量證據(jù)表明胰島β細胞凋亡參與糖尿病的發(fā)生，胰島β細胞凋亡造成胰島細胞分泌障礙，引起糖、蛋白質、脂肪代謝紊亂，最終導致糖尿病，近來的研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)質網(wǎng)應激(endoplasmic reticulum stress, ERS)是導致胰島細胞凋亡的重要環(huán)節(jié)[1],因此,深入研究和尋找以此為靶點治療T2DM的藥物顯得十分重要。果糖二磷酸鈉(fructose sodium diphosphate,FDP)是能在分子水平上調(diào)節(jié)細胞代謝中若干酶活性、恢復和改善細胞代謝的藥物，有文獻[2]報道FDP可降低鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)所致1型糖尿病大鼠的血糖水平，本課題組[3-4]也報道了一定濃度的FDP對IL-1β?lián)p傷的離體胰島細胞分泌功能有保護作用，其機制與降低NO的含量、細胞內(nèi)鈣離子濃度、血紅素加氧酶系統(tǒng)以及細胞凋亡有關，但FDP對T2DM大鼠的作用及機制研究報道甚少。本實驗通過建立小劑量STZ聯(lián)合高脂飲食誘導的T2DM大鼠模型,并予以FDP進行干預治療,探討FDP對T2DM模型大鼠胰島細胞的保護作用。

材 料 和 方 法

1試劑與動物

果糖二磷酸鈉(山東新華制藥股份有限公司，批號為0711079)，STZ(Sigma)，快速血糖測定儀(三諾SXT-1型，長沙三諾公司)，胰島素放射免疫檢測試劑盒(北京北方生物技術研究所)，多聚賴氨酸、Ⅰ抗、Ⅱ抗、SP、DAB均購于河北博海生物工程開發(fā)有限公司，原位細胞凋亡檢測試劑盒購自Roche。

3月齡雄性Wistar大鼠，一級，體質量(195±16)g。常規(guī)飼料：57%碳水化合物，22%蛋白質，6%脂肪，8%纖維素，7%其它成分。高能飼料(60%常規(guī)飼料，20%蔗糖，15%豬油，5%膽固醇)。動物及飼料均由四川省醫(yī)學科學院實驗動物研究所提供，動物合格證號為SCXK(川)2004-15。

2方法

2.1動物模型建立與分組 T2DM大鼠模型的建立參照既往方法[5]，首先適應性飼養(yǎng)1周，然后高能飼料喂養(yǎng)4周，空腹12 h后給予STZ(25 mg·kg-1, ip,注射前用pH=4.2的枸櫞酸緩沖液配成1%濃度)，對照組大鼠用等量枸櫞酸緩沖液處理，繼續(xù)高能飼料喂養(yǎng)4周后采尾靜脈血測定空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)和空腹血清胰島素(fasting serum insulin，F(xiàn)INS)，并計算胰島素敏感指數(shù)(insulin sensitivity index，ISI)，以FBG≥7.8 mmol·L-1作為T2DM模型判斷標準。實驗動物設立4組，每組8只：正常對照組(NOR)；模型對照組(MOR)；低劑量治療組(FDP1)；高劑量治療組(FDP2)。FDP1組每天上午注射FDP(2 mL·kg-1·d-1, ip)，F(xiàn)DP2組5 mL·kg-1·d-1，對照組每次給予等量生理鹽水處理。動物飼養(yǎng)于川北醫(yī)學院動物實驗中心，自由飲水，治療期間，全部大鼠常規(guī)飼料飼養(yǎng)。飼養(yǎng)期間定期檢測動物空腹血糖、胰島素水平。8周后，除去死亡動物，正常組8只，模型組7只，F(xiàn)DP低劑量組7只，高劑量組8只。實驗動物于治療8周末空腹12 h，然后從心臟采血制備血漿和血清標本-70 ℃保存待測，斷髓處死動物，每組動物摘取胰腺迅速凍存于液氮中待測。

2.2血糖、胰島素檢測 取大鼠尾靜脈血測定血糖，用血糖儀及配套的試紙定期檢測，方法參照說明書。胰島素用放免法測定，具體操作步驟嚴格按試劑盒說明書進行。

2.3β細胞凋亡檢測 應用原位末端標記法(TUNEL法)，石蠟切片常規(guī)脫蠟至水。滴加蛋白酶 K胃蛋白酶復合消化液 1滴 ,室溫孵育15～30 min，洗滌后滴加 TUNEL標記反應混合液 50 μL, 在濕盒中37 ℃孵育1 h,滴加 POD2轉化液 50 μL, 濕盒37 ℃孵育 30 min, PBS沖洗3次，DAB顯色。蘇木素復染細胞核，封片，光鏡下進行圖像分析，細胞核呈棕黃色為凋亡細胞。 用凋亡指數(shù)(apoptotic index,AI)表示細胞凋亡情況，即在高倍視野(×400)下，每只大鼠胰腺切片共計數(shù)5 個胰島,分別計數(shù)凋亡細胞和總細胞數(shù)，計數(shù)公式為：AI=(β細胞凋亡數(shù)/胰島細胞總數(shù))×100%。

2.4免疫組化檢測胰島c-JUN氨基末端激酶(c-JUN N-terminal kinase,JNK)和CHOP的表達 各組大鼠胰尾組織經(jīng)用4%多聚甲醛固定,常規(guī)石蠟制片。石蠟切片脫蠟、水化。1%甲醇雙氧水阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性, 經(jīng)抗原修復，正常山羊血清封閉液，室溫20 min。每張切片上分別滴加相應的Ⅰ抗，4 ℃過夜，0.1 mol/L PBS洗3次×5 min。滴加生物素化Ⅱ抗(IgG)，37 ℃ 20 min，0.1 mol/L PBS洗3次×5 min； DAB 顯色。Mayer’s 蘇木精對比染色。細胞漿染色棕黃色顯色為表達陽性。

采用評分法進行分析，評分標準： A為陽性細胞數(shù)分級：0～1%=0，(1～10)%=1，(10～50)%=2，(50～80)%=3，(80～100)%=4；B為陽性細胞顯色強度分級:0(陰性)、1(弱陽性)、2(陽性)、3(強陽性)，IHS=A×B。

3統(tǒng)計學處理

結 果

1大鼠的一般癥狀和體征變化

與正常對照組大鼠比較，建立的T2DM模型大鼠體重明顯增加，并出現(xiàn)腹型肥胖和多飲、多食、多尿的癥狀，毛發(fā)色澤黯淡，精神萎靡，活動減少，隨著病程延長，除大鼠體重呈下降趨勢外，其它癥狀逐漸加重；與模型對照組大鼠比較，F(xiàn)DP組干預8 周后，上述癥狀體征得到明顯改善，見表1。

2FDP干預前各組大鼠FBG、FINS和ISI的變化

那么，當四大元素從幕后登上前臺，介入世界歷史的進程；當多元決定論放大了細節(jié)，消解了宏大敘事并使之邊緣化之后，人類歷史是否就此終結?歷史作為一門學科或一門課程是否就此可以取消？

與NOR組比較，MOR、FDP1和FDP2組大鼠FBG、FINS與體重水平均顯著升高(P<0.01)，ISI顯著降低(P<0.01)；MOR、FDP1、FDP2組大鼠FBG、FINS與ISI的組間比較均無顯著差異(P>0.05)，見表1。FDP干預前大鼠血糖與胰島素水平均顯著升高，表明模型大鼠病理特點與2型糖尿病病理相符。

3FDP干預后各組大鼠FBG、FINS和ISI的變化

藥物治療8周后，MOR組與FDP1組各因為高血糖繼發(fā)感染死亡1只動物。與NOR組比較，MOR組大鼠FBG與FINS均顯著升高(P<0.01)，ISI與體重顯著降低(P<0.01)，表明糖尿病模型具有穩(wěn)定性。與MOR組比較，F(xiàn)DP1組FBG、FINS顯著降低(P<0.01)、FDP2組大鼠FBG與FINS均顯著降低(P<0.01)，治療組ISI與體重顯著升高(P<0.01)，表明FDP對糖尿病大鼠具有一定的治療作用。與FDP1組比較，F(xiàn)DP2組大鼠FBG與FINS均顯著降低(P<0.01)，ISI與體重顯著升高(P<0.01)，見表2。

表1FDP干預前各組大鼠FBG、FINS與ISI水平

GroupWeight(g)FBG(mmol/L)FINS(mIU/L)ISINOR295±246.07±0.5415.75±2.12-4.16±0.22MOD330±27#6.35±2.42#21.41±3.45#-5.81±0.43##FDP1335±30#16.44±2.65#21.87±3.63#-5.74±0.46##FDP2332±28#16.22±2.13#20.72±3.26#-5.58±0.39##

#P<0.05,##P<0.01vsNOR group.NOR:normal;MOD:model;FDP1:2 mL·kg-1·d-1;FDP2:5 mL·kg-1·d-1.

4胰島細胞凋亡的影響

高脂飼養(yǎng)組大鼠胰島細胞內(nèi)可見較多凋亡細胞，細胞核染色質濃縮，呈棕黃色，β細胞凋亡較正常組明顯增加，圖1顯示NOR組有少量細胞凋亡，MOR組細胞凋亡明顯高于NOR組(P<0.01),FDP低劑量組、高劑量組AI與MOR組比較AI降低，有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，與FDP1組相比，F(xiàn)DP2組AI明顯降低，差異顯著(P<0.01)，見表3。

表2 FDP干預后各組大鼠FBG、FINS與ISI水平

▲▲P<0.01vsNOR group;△△P<0.01vsMOR group;**P<0.01vsFDP1group.

Figure 1. Effect of FDP on apoptosis of islets cells in rats of various groups(TUNEL,×400).A:normal;B:model;C:FDP1;D:FDP2.

圖1TUNEL法檢測各組大鼠胰島細胞凋亡的程度

5FDP對糖尿病大鼠CHOP蛋白表達的影響

CHOP主要是在胰島細胞的胞漿中表達，陽性細胞胞漿內(nèi)可見棕黃色顆粒。圖2和表3顯示正常組表達較少，模型組CHOP蛋白表達評分0.38±0.07，顯著高于正常組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，F(xiàn)DP1和FDP2組CHOP蛋白表達比模型組降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.01)；與FDP1組相比，F(xiàn)DP2組CHOP的表達明顯降低，差異顯著(P<0.05)。

6FDP對糖尿病大鼠胰島JNK蛋白表達的影響

JNK主要是在胰島細胞的胞漿中表達，陽性細胞胞漿內(nèi)可見棕黃色顆粒。圖3和表3顯示，正常組表達較少，模型組JNK蛋白表達評分1.420±0.165，顯著高于NOR組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，F(xiàn)DP1、FDP2組JNK蛋白表達比MOR降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);與FDP1組相比，F(xiàn)DP2組JNK的表達明顯降低，差異顯著(P<0.05)。

表3各組大鼠胰島細胞凋亡指數(shù)、CHOP和JNK蛋白水平的表達

GroupAI(%)CHOPJNKNOR0.17±0.050.07±0.020.14±0.04MOD0.69±0.14**0.38±0.07**1.42±0.17**FDP10.43±0.03△0.22±0.03△0.46±0.06△△FDP20.29±0.07△△##0.13±0.03△△##0.35±0.06△△#

**P<0.01vsNOR group;△P<0.05，△△P<0.01vsMOR group;#P<0.05,##P<0.01vsFDP1group.

Figure 2. The expression of CHOP in islets cells of diabetes rats in various groups detected by immunohistochemistry staining(×400).A:normal;B:model;C:FDP1;D:FDP2.

圖2免疫組化檢測各組糖尿病大鼠胰島CHOP的表達

Figure 3. The expression of JNK in islets cells of diabetes rats in various groups detected by immunohistochemical staining(×400).A:normal;B:model;C:FDP1;D:FDP2.

圖3免疫組化檢測各組糖尿病大鼠胰島JNK的表達

討 論

T2DM的發(fā)病機制主要為胰島素抵抗和胰島β細胞受損兩方面，研究已證實糖尿病患者的胰島β細胞數(shù)量顯著減少, 且β細胞凋亡是導致胰島β細胞數(shù)量減少的主要原因。因此胰島β細胞凋亡與糖尿病發(fā)生密切相關。ERS介導細胞凋亡是最近提出的新的凋亡通路,胰島細胞的一個重要特點是具有高表達的內(nèi)質網(wǎng)，參與內(nèi)質網(wǎng)應激的多種信號分子在β細胞內(nèi)均有高表達[6]，報道顯示長期和低水平ERS可導致大量β細胞凋亡，從而引發(fā)糖尿病[7]，干預內(nèi)質網(wǎng)應激，降低胰島細胞凋亡已經(jīng)成為糖尿病研究的熱點領域。

ERS是指由某種原因使細胞內(nèi)質網(wǎng)生理功能紊亂的一種亞細胞器病理狀態(tài)，葡萄糖或營養(yǎng)物質缺乏、脂質過度負荷、病毒感染、毒素和分泌蛋白合成增加均可打破內(nèi)質網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)，導致蛋白質折疊障礙或錯誤折疊，進而觸發(fā)ERS。胰島細胞的一個重要特征就是高度發(fā)達的內(nèi)質網(wǎng)，是對ERS最敏感的組織之一。在由內(nèi)質網(wǎng)應激誘導β細胞凋亡的信號通路中，研究較多的是CHOP調(diào)控的β細胞凋亡信號通路和JNK通路。

CHOP是一種ERS特異蛋白，又稱生長抑制和DNA損傷誘導基因153對細胞增生及分化具有十分重要的作用，大多數(shù)生理條件下，主要在細胞漿中，含量不高，但是在各種應激情況下，表達顯著增加。Oyadoman等[8]發(fā)現(xiàn)CHOP基因敲除可增強細胞對抗ERS所致凋亡能力，能夠阻止T2DM的發(fā)生。JNK信號轉導蛋白家族在應激反應和細胞凋亡中發(fā)揮重要作用，在過高ERS發(fā)生時，活化的IRE1結合TRAF2，與凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1形成復合體進一步激活JNK，磷酸化的JNK激活凋亡蛋白Bim，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2，從而誘導細胞凋亡[9]，Bachar等[10]在對胰島細胞的研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質網(wǎng)應激導致胰島細胞凋亡增加與上調(diào)CHOP和JNK的表達有關，張研等[11]對胰島β細胞系INS - 1細胞的研究也證實，高糖增加胰島細胞凋亡是通過激活JNK通路。本實驗也證明在T2DM大鼠胰島細胞凋亡增加，CHOP和JNK的表達增加，與文獻報道結果相似。

FDP是糖分解代謝的中間產(chǎn)物，其鈉鹽是在分子水平上恢復和改善細胞代謝的藥物，對多種組織器官的缺氧、缺血均有確切的保護作用，已被廣泛應用于心血管、腦組織損害的保護。本課題組已經(jīng)證實了FDP對IL-1β?lián)p傷的胰島活性和分泌功能有保護作用，而且降低離體胰島細胞凋亡率，本實驗通過在體實驗進一步探討FDP對T2DM大鼠模型胰島細胞的保護作用以及其機制。實驗結果顯示，通過小劑量STZ注射聯(lián)合高糖高脂飲食建立T2DM大鼠模型,并予FDP干預治療,結果顯示經(jīng)過FDP治療8周后,NOR +FDP組的血糖較MOR組顯著下降,胰島素水平增加，提示FDP可以保護T2DM大鼠胰島細胞功能。結果提示T2DM大鼠凋亡細胞增加，與正常組有顯著差異，給予FDP干預后，凋亡細胞減少，具有統(tǒng)計學意義。說明FDP可以改善T2DM大鼠的凋亡發(fā)生，從而保護胰島細胞的分泌功能。結果還顯示FDP干預后，T2DM大鼠CHOP和JNK 的表達降低，說明FDP減輕T2DM大鼠胰島凋亡與降低內(nèi)質網(wǎng)應激蛋白CHOP 和 JNK的表達相關。綜上所述，F(xiàn)DP通過降低胰島細胞凋亡的發(fā)生保護胰島細胞功能，其機制與減輕內(nèi)質網(wǎng)應激蛋白CHOP和JNK的表達有關，進一步研究FDP減輕內(nèi)質網(wǎng)應激的分子機制將為臨床應用提供理論和實驗基礎。

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EffectsoffructosesodiumdiphosphateonexpressionofCHOPandJNKinendoplasmicreticulumstressandisletapoptosisinratswithtype2diabetes

ZHENG Qian1, LIU Hong1, LIU Hua1, CAO Di-yong2, LAN Hai-tao1

(1DepartmentofPhysiology,2DepartmentofPharmacology,NorthSichuanMedicalCollege,Nanchong637107,China.E-mail:lhtr1682002@yahoo.com.cn)

AIM: To study the effects of fructose sodium diphosphate (FDP) on the expression of CHOP and c-Jun N-terminal binase(JNK) in endoplasmic reticulum stress and islet apoptosis in the rats with type 2 diabetes mellitus (T2DM).METHODST2DM model was established in male Wistar rats by feeding of high lipid diet and injection of streptozotocin. The rats were divided into 4 groups (n=8):normal control group, T2DM model group, T2DM+low-dose FDP (2 mL·kg-1·d-1, ip) group and T2DM+high-dose FDP (5 mL·kg-1·d-1, ip) group. The rats in the treatment groups

FDP for 8 weeks. The levels of fasting blood glucose (FBG), fasting serum insulin (FINS) and insulin sensitivity index (ISI) were measured. TUNEL was used to detect the islet apoptosis. The protein levels of CHOP and JNK were determined by the method of immunohistochemistry.RESULTS(1) Compared with normal control group, FBG, FINS, the expression of CHOP and JNK, and apoptosis in T2DM model group were significantly increased (P<0.01). The level of ISI was significantly decreased. (2) Compared with T2DM model group, the levels of FBG and FINS, the expression of CHOP and JNK, and apoptosis in high-dose FDP group were significantly decreased. The level of ISI was significantly increased (P<0.01). However, the level of FBG, the expression of CHOP and JNK, and apoptosis in low-dose FDP group were significantly decreased. Compared with low-dose FDP group, the levels of FBG and FINS, the expression of CHOP and JNK, and apoptosis in high-dose FDP group were significantly decreased. The level of ISI was significantly increased (P<0.01 orP<0.05).CONCLUSIONFDP may prevent islet cells from apoptosis in T2DM rats by decreasing the expression of CHOP and JNK.

Fructose sodium diphosphate; Diabetes mellitus; Apoptosis; Endoplasmic reticulum stress; Islet cells

R332

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.04.028