徐柯樂， 陳 勤， 劉 偉， 姚媛媛， 夏醒醒， 張蓓蕾， 李燕斐

(安徽大學生命科學學院，安徽省中藥研究與開發(fā)重點實驗室，安徽 合肥 230039)

1000-4718(2012)09-1605-05

2012-04-02

2012-05-15

安徽省教育廳自然科學研究項目(No.KJ2009A116;No.KJ2011068)；安徽省教育廳省級《細胞生物學》精品課程項目(No.2009024);教育部大學生創(chuàng)新性實驗項目(No.2041044)

△通訊作者 Tel：0551-5108552；E-mail：chenqin169@163.com

遠志皂苷減輕Aβ1-40誘導的AD大鼠腦神經(jīng)元tau蛋白Ser396位點的過度磷酸化*

徐柯樂， 陳 勤△， 劉 偉， 姚媛媛， 夏醒醒， 張蓓蕾， 李燕斐

(安徽大學生命科學學院，安徽省中藥研究與開發(fā)重點實驗室，安徽 合肥 230039)

目的探討遠志皂苷對β-淀粉樣肽1-40(Aβ1-40)誘導的阿爾茨海默病(AD)大鼠腦神經(jīng)元tau蛋白過度磷酸化的影響。方法大鼠右側(cè)海馬CA1區(qū)注射Aβ1-40建立AD模型，并用遠志皂苷(18.5 mg/kg、37.0 mg/kg和74.0 mg/kg)對大鼠進行灌胃治療；免疫組織化學染色法觀察大腦神經(jīng)元中總tau蛋白、p-tau(Ser396)、蛋白激酶A(PKA)和蛋白磷酸酶2A(PP2A)蛋白的表達；蛋白免疫印跡技術檢測大腦神經(jīng)元中總tau蛋白含量、tau蛋白Ser396位點磷酸化以及PKA、PP2A蛋白的表達水平。結(jié)果與對照組相比，Aβ1-40組大腦神經(jīng)元中總tau蛋白含量、tau蛋白Ser396位點磷酸化水平和PKA蛋白的表達水平顯著升高，而PP2A蛋白的表達水平明顯降低。與Aβ1-40組相比，遠志皂苷各治療組大鼠大腦神經(jīng)元中總tau蛋白含量、tau蛋白Ser396位點磷酸化水平和PKA蛋白表達水平下降明顯，而PP2A蛋白表達水平顯著升高。結(jié)論遠志皂苷可能是通過下調(diào)PKA蛋白表達量，上調(diào)PP2A蛋白表達量，減輕AD大鼠腦神經(jīng)元中tau蛋白Ser396位點的過度磷酸化，使神經(jīng)細胞免遭Aβ1-40的毒害。

遠志皂苷； β-淀粉樣肽； 阿爾茨海默?。?大鼠； Tau蛋白； 磷酸化

阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)是一種常見于老年人群中的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行疾病。尸解發(fā)現(xiàn)其主要病理特征為老年斑(senile plaque，SP)、神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles，NFTs)及神經(jīng)細胞凋亡等[1]。研究發(fā)現(xiàn)NFTs的主要成分是過度磷酸化的tau蛋白，正常水平磷酸化的tau 蛋白對于微管的組裝和穩(wěn)定有著重要作用，而過度磷酸化的tau蛋白則喪失其生理功能，導致微管解聚和細胞骨架損毀，最終導致神經(jīng)細胞凋亡。Tau蛋白的磷酸化水平受到細胞內(nèi)蛋白激酶A(protein kinase A，PKA) 和蛋白磷酸酶2A(Aprotein phosphatase 2A，PP2A)的共同調(diào)節(jié)。中藥遠志的主要藥用成分是遠志皂苷(tenuigenin，TEN)，藥理和臨床研究表明，其具有改善記憶、抗氧化、抗衰老、強心、降壓及抗癡呆的作用[2]。本室前期實驗已證明[3-6]，TEN對腦內(nèi)注射β-淀粉樣肽1-40(amyloid β-peptide 1-40,Aβ1-40)的AD大鼠和小鼠的學習記憶均有顯著的改善效應，并證明其對Aβ1-40誘導的原代神經(jīng)細胞的神經(jīng)毒性有一定的治療效果。但TEN對Aβ誘導的AD大鼠腦神經(jīng)元中tau蛋白磷酸化是否有干預作用，目前尚未見報道。本研究采用大鼠右側(cè)海馬注射Aβ1-40建立AD大鼠模型，并用TEN進行干預治療，觀察TEN對AD大鼠腦神經(jīng)元tau蛋白磷酸化水平的影響。

材 料 和 方 法

1材料

1.1藥物 TEN由本室自制，含TEN甲素、TEN乙素等成分，經(jīng)高效液相色譜法測定，其中TEN甲素含量為72%。

1.2動物 SD大鼠，體重(280±30) g，雌雄兼用，由安徽醫(yī)科大學實驗動物中心提供，合格證號為皖醫(yī)動準字01號。

1.3試劑 Aβ1-40購自Sigma。臨用前以無菌生理鹽水將Aβ1-40稀釋成1 g/L，37 ℃孵育l周，并小心攪拌，使其變?yōu)榫奂癄顟B(tài)的Aβ[4]。兔抗β-actin、兔抗PKA多克隆抗體、鼠抗PP2A多克隆抗體、兔抗tau蛋白多克隆抗體和辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG均為北京博奧森生物技術有限公司產(chǎn)品；兔抗p-tau(Ser396)為南京金斯瑞生物科技有限公司產(chǎn)品；生物素標記羊抗鼠IgG為江蘇碧云天生物公司產(chǎn)品；生物素標記羊抗兔IgG、正常山羊血清和SABC免疫組化試劑盒均為武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品；HRP-DAB底物顯色試劑盒和化學發(fā)光試劑均為天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品。

1.4儀器 江灣I型C腦立體定位儀，第二軍醫(yī)大學產(chǎn)品；2315型石蠟切片機，Leica產(chǎn)品；Olympus BX41熒光顯微鏡(帶DP70攝像系統(tǒng))，Olympus產(chǎn)品；5417型臺式冷凍離心機，Eppendorf產(chǎn)品；DYCZ-24DN型，迷你雙垂直電泳儀(槽) 、DYCZ-40D型半干式轉(zhuǎn)移電泳槽，均為北京市六一儀器廠產(chǎn)品。

2方法

2.1動物模型制作與實驗分組 取SD大鼠50只，隨機分為：(1)對照組；(2)Aβ1-40組；(3)～(5)組為TEN低、中、高3個劑量組，每組10只。按前文報道的方法[3]行腦定位右側(cè)海馬CA1區(qū)注射(位置：前囟后3.0 mm，中線旁開2.0 mm，深度2.9 mm)。(2)～(5)組大鼠一次性注射Aβ1-40，每鼠1 μL，(1)組大鼠同部位注射等量無菌生理鹽水。術后給予青霉素鈉鹽4×104U肌注，每天1次，連續(xù)3 d。術后第4 d起，(3)～(5)組大鼠分別灌胃 TEN 18.5 mg/kg、37.0 mg/kg及74.0 mg/kg，(1)和(2)組大鼠灌胃等體積生理鹽水。連續(xù)用藥30 d。

2.2取材及樣本制備 大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，剪開胸腔暴露心臟，灌注針從左心室插入致主動脈根底，用手術剪剪開右心耳，先快速灌注生理鹽水沖洗致流出液體無血水，再灌注4%多聚甲醛，待肝臟變成灰白色停止灌注，斷頭取腦，PBS清洗后，用10%中性甲醛固定，常規(guī)脫水、浸蠟、包埋、進行冠狀切片，片厚4 μm。取0.2 g腦組織加1 mL蛋白裂解液，研磨裂解20 min(以上過程均在冰浴中完成)，低溫(0 ℃)高速(14 000 r·min-1)離心10 min，取上清置-20 ℃冰箱貯存?zhèn)溆谩?/p>

2.3免疫組織化學檢測 石蠟切片常規(guī)脫蠟復水，用1% H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶20 min，PBS洗3次每次5 min，用0.01 mol·L-1枸櫞酸鹽緩沖液沸水煮10 min，PBS洗3次每次5 min，5%新鮮山羊血清封閉37 ℃孵育30 min(勿洗，甩干即可)，加Ⅰ抗[總tau、p-tau(Ser396)、PKA和PP2A，PBS按1∶100稀釋]，濕盒內(nèi)孵化4 ℃過夜，滴加生物素標記的Ⅱ抗應用液(1∶100)，37 ℃孵育2 h，滴加2滴SABC 37 ℃孵育45 min，0.02% PBST溶液浸洗防非特異性背景，DAB顯色，蘇木精復染，梯度乙醇脫水，透明，中性樹膠封固。設立0.01 mol·L-1PBS代替Ⅰ抗作陰性對照。每個樣本隨機抽取1張腦片，在光鏡下隨機選取海馬CA1區(qū)1個視野(×400)，數(shù)200個細胞中的陽性細胞數(shù)，統(tǒng)計陽性細胞數(shù)。

2.4Western blotting檢測 提取的蛋白樣品用BCA試劑盒進行蛋白定量。取適量樣品，加入等體積的2×上樣緩沖液(1 mol·L-1pH 6.8 Tris-HCl，2.5 mL；β-巰基乙醇，1.0 mL；SDS，0.6 g；甘油，2.0 mL；0.1%溴酚藍水溶液，1.0 mL；超純水，3.5 mL)混勻，在100 ℃沸水中煮5 min，各組取15 μg樣品進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠(5%濃縮膠、12%分離膠)電泳分離，先用100 V電泳待溴酚藍至濃縮膠底改用120 V電泳，當溴酚藍距離分離膠底1 cm時停止電泳。分離的蛋白在250 mA、冰浴條件下轉(zhuǎn)膜150 min，將目的蛋白轉(zhuǎn)移到NC膜上，用TBST簡單洗膜，室溫下用新配的5%脫脂奶粉封閉作用3 h，TBST簡單洗膜后加入TBST稀釋的Ⅰ抗[β-actin(1∶1 000) 、總tau(1∶500)、p-tau(Ser396)(1∶700)、PKA(1∶500)和PP2A(1∶500)]4 ℃過夜；TBST洗滌3×20 min，加入TBST稀釋的辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗(1∶2 000)室溫孵育2 h，TBST洗滌2×20 min，TBS洗滌15 min，用化學發(fā)光劑避光反應2～3 min，將NC膜置于保鮮膜包裹好后置于片夾中，在暗室中感光在膠片上。以β-actin作為內(nèi)參照，統(tǒng)計各組蛋白與β-actin灰度值的比值。

3統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

1TEN對AD大鼠腦神經(jīng)元總tau及p-tau(Ser396)表達的影響

采用免疫組化法分別檢測神經(jīng)元總tau及p-tau(Ser396)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對照組大鼠皮層和海馬區(qū)神經(jīng)元中有極少量的tau及p-tau(Ser396)棕黃色斑塊出現(xiàn)，大多數(shù)神經(jīng)元形態(tài)完整，軸突結(jié)構(gòu)明顯，而Aβ1-40組大鼠皮層和海馬區(qū)神經(jīng)元中tau及p-tau(Ser396)陽性細胞數(shù)顯著增多，尤以海馬CA1區(qū)最甚，與對照組相比，差異顯著(P<0.01)；當連續(xù)用藥30 d后，TEN 3個劑量組大鼠皮層和海馬區(qū)神經(jīng)元中tau及p-tau(Ser396)陽性細胞數(shù)明顯減少，以高劑量組效果最佳(均P<0.01)。蛋白免疫印記檢測進一步證實，Aβ1-40組大鼠神經(jīng)元中總tau和p-tau(Ser396)蛋白表達上調(diào)，與對照組比較，差異顯著(P<0.01)，而經(jīng)TEN干預治療后，3個劑量組總tau和p-tau(Ser396)蛋白表達下調(diào)明顯(均P<0.01)，提示TEN對總tau蛋白和tau磷酸化有一定的抑制作用，見圖1～3。

Figure 1. Effect of TEN on the expression of total tau protein in CA1 region neurons of the hippocampus of AD rats(×400).A: sham operation group；B: Aβ1-40group；C: Aβ1-40+TEN(18.5 mg·kg-1) group；D: Aβ1-40+TEN(37.0 mg·kg-1) group；E: Aβ1-40+TEN(74.0 mg·kg-1) group.

圖1TEN對AD大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元總tau蛋白表達的影響

2TEN對AD大鼠腦神經(jīng)元PKA和PP2A表達的影響

免疫組化顯示，對照組大鼠皮層和海馬中的PKA陽性細胞分布較少，而PP2A陽性細胞數(shù)明顯增多，而Aβ1-40組大鼠皮層和海馬區(qū)神經(jīng)元中可見到大量的棕黃色斑塊的PKA陽性細胞，而PP2A陽性細胞數(shù)卻明顯減少，說明腦內(nèi)注射Aβ1-40可引起PKA活性增高和PP2A活性降低。當連續(xù)對AD大鼠灌胃給予TEN 30 d后，發(fā)現(xiàn)TEN 3個劑量治療組均可以減低PKA的活性，增強PP2A的活性，與Aβ1-40組比較，差異顯著(均P<0.01)。蛋白免疫印跡檢測顯示，Aβ1-40組大鼠神經(jīng)元中PKA表達量上調(diào)(P<0.01)；而PP2A表達量下調(diào)(P<0.01)。經(jīng)TEN干預治療后，TEN治療組PKA表達量較模型組明顯降低，而PP2A表達量較模型組顯著升高，3個劑量組呈明顯的量效關系(均P<0.01)，圖2、4。

討 論

Tau蛋白是微管相關蛋白(microtubule-associated proteins，MAPs)中含量最高的組分。在正常人大腦中，tau蛋白處于一種低水平的磷酸化狀態(tài)(含2～3個磷酸基)，但在AD患者大腦中tau蛋白出現(xiàn)多位點的異常磷酸化，異常磷酸化的tau蛋白自身聚集成PHF/NFT結(jié)構(gòu)，最終誘發(fā)神經(jīng)元微管結(jié)構(gòu)廣泛破壞，正常軸突轉(zhuǎn)運受損，引起突觸丟失神經(jīng)元功能損傷，發(fā)生腦神經(jīng)退行性病變[7-8]。目前，在PHF-tau中已鑒定出45個磷酸化位點[9]，尤其是Ser396、Ser404、Ser199/202、Thr231和Thr181位點的磷酸化，可以改變tau蛋白與微管結(jié)合部位的構(gòu)象，導致微管解體，細胞骨架破壞[10-11]。研究表明，Aβ的產(chǎn)生和在大腦皮層的沉積是AD形成和發(fā)展的重要因素[12]，大鼠腦內(nèi)注射凝集態(tài)Aβ可導致tau蛋白特定位點磷酸化水平升高和神經(jīng)元凋亡。本實驗采用大鼠右側(cè)海馬CA1區(qū)注射Aβ1-40建立AD模型，并應用免疫組化和蛋白免疫印跡術觀察總tau及tau蛋白磷酸化變化水平，發(fā)現(xiàn)Aβ1-40可導致大鼠腦神經(jīng)元總tau蛋白及p-tau(Ser396)的表達上升，而連續(xù)口服TEN 30 d后，各治療組總tau蛋白及tauSer396位點磷酸化水平呈現(xiàn)不同程度的降低，其中以高劑量組效果最為明顯，揭示TEN能降低AD大鼠腦細胞中總tau蛋白含量和tau蛋白磷酸化水平，恢復tau蛋白的正常生理功能，有助于微管的組裝與穩(wěn)定性，防止NFT的形成。

圖2TEN對AD大鼠神經(jīng)元PKA、PP2A、總tau蛋白和p-tau(Ser396)表達的影響

圖3TEN對AD大鼠神經(jīng)元總tau蛋白和p-tau(Ser396)表達量的影響

圖4TEN對AD大鼠神經(jīng)元PKA和PP2A表達量的影響

細胞內(nèi)tau蛋白磷酸化水平主要受蛋白激酶(如PKA、GSK-3β等)和蛋白磷酸酶(如PP2A、PP2B等)的調(diào)節(jié)，正常情況下tau蛋白磷酸化與去磷酸化處于動態(tài)平衡。但在AD時這種動態(tài)平衡遭到破壞而引起tau蛋白磷酸化異常增高。PKA是催化tau蛋白磷酸化最重要的蛋白激酶之一，它不僅自身直接催化tau蛋白多個位點的磷酸化，而且其對tau蛋白的預磷酸化使tau蛋白的構(gòu)象發(fā)生改變更易被GSK-3β、CDK5等蛋白激酶磷酸化[13]。PP2A是神經(jīng)細胞中活性最強的磷酸酶，它能催化異常磷酸化tau蛋白去磷酸化(脫磷酸基)、釋放游離tau蛋白、恢復tau蛋白生物學活性以及松解NFT纏繞結(jié)構(gòu)[14-15]。用PP1和PP2A的抑制劑可引起大鼠海馬神經(jīng)元突觸和樹突丟失，伴有tau蛋白的過度磷酸化[16]。另外在PP2A基因突變小鼠腦中發(fā)現(xiàn)tau蛋白異常過度磷酸化現(xiàn)象[17]。研究證明，AD患者腦中PP2A和PP2B活性均低于正常老人。目前認為AD患者大腦神經(jīng)細胞中蛋白激酶活性增高和磷酸酶活性缺陷可能是引起tau蛋白過度磷酸化的主要原因。本研究發(fā)現(xiàn)大鼠腦內(nèi)注射Aβ1-40可導致PKA表達含量升高及PP2A的活性受到抑制，經(jīng)TEN干預治療后，PKA表達含量明顯降低，同時PP2A的活性恢復。

綜上所述，TEN對AD大鼠腦神經(jīng)元的保護作用可能是通過下調(diào)PKA蛋白和上調(diào)PP-2A蛋白表達，從而降低腦神經(jīng)元總tau蛋白含量，恢復tau蛋白正常磷酸化，進而達到保護腦神經(jīng)元的作用。關于TEN治療AD是否還有其它途徑，尚待進一步研究。

[1] Kayed R．Anti-tau oligomers passive vaccination for the treatment of Alzheimer disease[J]．Hum Vaccin，2010，6(11)：931-935．

[2] 姜 勇，屠鵬飛． 遠志的研究進展[J]．中草藥，2001，32(8)：759- 761．

[3] 陳 勤，曹炎貴，張傳惠，等．遠志皂苷對β-淀粉樣肽和鵝膏蕈氨酸引起膽堿能系統(tǒng)功能降低的影響[J]．藥學學報，2002，37(12)：913- 917．

[4] 陳 勤，高晨曦，葛禮浩．遠志皂苷對腦定位注射Aβ1-40擬AD大鼠腦內(nèi)神經(jīng)形態(tài)病理學變化的影響[J]．激光生物學報，2006，15(3)：294- 298．

[5] 陳 勤，李磊珂．遠志皂苷對β淀粉樣蛋白1-40誘導的體外培養(yǎng)皮層神經(jīng)細胞損傷的保護作用[J]．中國中藥雜志，2007，32(13)：1336- 1339．

[6] 陳慶林，陳 勤，金蓓蓓．遠志皂苷對AD小鼠學習記憶能力及中樞膽堿能系統(tǒng)標志酶活性的影響[J]．中藥藥理與臨床，2011，27(3)：33- 36．

[7] 張 蕊，苑玉和，趙 明，等．細胞骨架與神經(jīng)退行性疾病[J]． 中國藥理學通報，2011，27(8)：1041-1044．

[8] Blennow K，deLeon MJ，Zetterberg H．Alzheimer’s disease[J]．Lancet，2006，368 (9533)：387-403．

[9] Hanger DP，Anderton BH，Noble W．Tau phosphorylation：the therapeutic challenge for neurodegenerative disease[J]．Teeads Mol Med，2009，15(3)：112-119．

[10]Zhou XW， Li X， Bjorkdahl C，et al．Assessments of the accumulation severities of amyloid beta-protein and hyperphosphorylated tau in the medial temporal cortex of control and Alzheimer’s brains[J]．Neurobiol Dis，2006， 22(3)：657-668．

[11]Liu SJ，Zhang AH， Li HL，et al．Overactivation of glycogen synthase kinase-3 by inhibition of phosphoinositol-3 kinase and protein kinase C leads to hyperphosphorylation of tau and impairment of spatial memory[J]．J Neurochem，2003，87(6)：1333-1344．

[12]Yatin SM，Aksenova M，Aksenov M,et al．Temporal relations among amyloid β-peptide-induced free-radical oxidative stress，neuronal toxicity，and neuronal defensive responses[J]．J Mol Neurosci，1998，11(3)：183-197．

[13]Gong CX， Liu F， Grundke-Iqbal I，et al． Post-translational modifications of tau protein in Alzheimer’s disease[J]．J Neural Transm，2005，112(6):813-838．

[14]胡志紅，田 青，王建枝，等. 絲氨酸蘇氨酸蛋白磷酸酯酶在tau蛋白異常磷酸化中的作用[J]. 生理科學進展，2006，37(2)：33-37.

[15]魯遠君. 阿爾茨海默病中針對tau蛋白治療的研究進展[J]. 中國神經(jīng)免疫學和神經(jīng)病學雜志，2008，15(3)：211-213.

[16]Vogelsberg-Ragaglia V，Schuck T，Trojanowski JQ，et al．PP2A mRNA expression is quantitatively decreased in Alzheimer’s disease hippocampus[J]．Exp Neurol，2001，168(2)：402-412．

[17]Schild A，Ittner LM， Gotz J．Altered phosphorylation of cytoskeletal proteins in mutant protein phosphatase 2A transgenic mice[J]．Biochem Biophys Res Commun，2006，343(4)：1171-1178．

EffectoftenuigeninontauproteinphosphorylationatSer396siteinneuronsofADratsinducedbyAβ1-40

XU Ke-le, CHEN Qin, LIU Wei, YAO Yuan-yuan, XIA Xing-xing, ZHANG Bei-lei, LI Yan-fei

(SchoolofLifeScience,AnhuiUniversity,AnhuiProvinceKeyLaboratoryofR&DofChineseMedicine,Hefei230039,China.E-mail:chenqin169@163.com)

AIM: To investigate the effect of tenuigenin (TEN) on hyperphosphorylation of tau protein in neurons of amyloid β-peptide1-40(Aβ1-40) -induced Alzheimer disease (AD) rats.METHODSAβ1-40was injected into hippocampus CA1 region of the rats to establish AD model. TEN at different doses (18.5 mg/kg, 37.0 mg/kg and 74.0 mg/kg) was intragastrically administered. The protein expression of protein kinase A (PKA),protein phosphatase 2A (PP2A), total tau and p-tau (Ser396) in the neurons was observed by the method of immunohistochemistry. The protein content of total tau and p-tau (Ser396), and the expression level of PKA and PP-2A were detected by Western blotting analysis.RESULTSIn Aβ1-40group, the level of total tau, the phosphorylation of tau protein and the expression of PKA were significantly increased compared with those in sham operation group. Meanwhile, the expression of PP2A in Aβ1-40group was lower than that in sham operation group. In TEN treatment group, the level of total tau, the phosphorylation of tau protein and the expression of PKA were markedly decreased, and the expression of PP2A was increased as compared with Aβ1-40group.CONCLUSIONTEN may protect the neurons from the toxic effect of Aβ1-40and reduce the hyperphosphorylation of tau (Ser396) in the neurons of AD rats by activating the expression of PP2A and inhibiting the expression of PKA.

Tenuigenin; Amyloid β-peptide; Alzheimer disease; Rats; Tau protein; Phosphorylation

R966

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.09.012