郭小芳， 劉海波， 任惠龍， 陳宏衛(wèi)， 賴靜波， 龔維坤， 成興波， 盧國元

(鄞州人民醫(yī)院 1內(nèi)分泌科， 2心內(nèi)科，浙江 寧波 315040；蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院 3內(nèi)分泌科， 4腎內(nèi)科，江蘇 蘇州 215006)

1000-4718(2012)09-1565-06

2012-03-29

2012-07-13

△通訊作者 Tel：0574-87016961；E-mail:liuhaibo79@eyou.com

葡萄糖對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞蛋白C受體表達(dá)的影響及吡格列酮的干預(yù)作用

郭小芳1,3， 劉海波2△， 任惠龍1， 陳宏衛(wèi)1， 賴靜波1， 龔維坤1， 成興波3， 盧國元4

(鄞州人民醫(yī)院1內(nèi)分泌科，2心內(nèi)科，浙江 寧波 315040；蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院3內(nèi)分泌科，4腎內(nèi)科，江蘇 蘇州 215006)

目的研究葡萄糖對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞蛋白C受體(EPCR) mRNA 表達(dá)的影響，以及吡格列酮的干預(yù)作用。方法體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)，分別以流式細(xì)胞術(shù)和RT-PCR技術(shù)確認(rèn)HUVECs膜上EPCR的表達(dá)水平和 mRNA 水平的表達(dá)。再分別以含不同濃度D-葡萄糖(5、10、30、50 mmol/L)的培養(yǎng)基以及含吡格列酮(5、10、20 μmol/L)或不含吡格列酮的高糖(50 mmol/L)培養(yǎng)基孵育HUVECs 24 h，行劑量和時間依賴性實驗，并采用實時定量PCR技術(shù)測定HUVECs細(xì)胞 EPCR mRNA 的表達(dá)。結(jié)果隨著培養(yǎng)基D-葡萄糖濃度的增加，HUVECs培養(yǎng)24 h后其EPCR mRNA 的表達(dá)逐漸下調(diào)。在采用吡格列酮干預(yù)后， 50 mmol/L高糖處理的HUVECs EPCR mRNA 表達(dá)的下調(diào)得到明顯改善。結(jié)論(1)EPCR 在HUVECs上高表達(dá)，高糖可通過下調(diào)EPCR mRNA 的表達(dá)而損傷內(nèi)皮細(xì)胞功能。(2)吡格列酮可阻止高糖誘導(dǎo)的HUVECs EPCR mRNA表達(dá)的下調(diào)，從而保護內(nèi)皮細(xì)胞功能。

內(nèi)皮細(xì)胞； 葡萄糖； 吡格列酮； 內(nèi)皮細(xì)胞蛋白C受體

高血糖是糖尿病(diabetes mellitus，DM)大血管并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展的主要危險因素，而糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)生與內(nèi)皮功能受損密切相關(guān)[1]，內(nèi)皮功能受損后可引起凝血活化及一系列的炎癥反應(yīng)[2]，從而參與動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)的進程。因此減少血管內(nèi)皮功能損傷，對防治糖尿病血管并發(fā)癥具有重要的臨床意義。 內(nèi)皮細(xì)胞蛋白C受體(endothelial cell protein C receptor，EPCR) 是近年發(fā)現(xiàn)的蛋白C(protein C，PC)系統(tǒng)的一個新成員，主要表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞，它能與PC特異性結(jié)合，使PC活化效率提高5倍，而發(fā)揮抗凝作用[3]。同時有研究表明EPCR也有重要的抗炎作用[4]。因此，EPCR在維持血管內(nèi)皮功能中發(fā)揮著重要的作用。 吡格列酮(pioglitazone)是近年來發(fā)現(xiàn)的一類新型口服胰島素增敏劑，已有研究表明吡格列酮具有抗炎及保護內(nèi)皮功能的作用[5]，但其具體機制尚不十分清楚。 本研究通過體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)，初步探討高糖對HUVECs EPCR mRNA 表達(dá)的影響，以及吡格列酮對高糖造成的內(nèi)皮細(xì)胞 EPCR mRNA 表達(dá)下調(diào)的改善作用，探討糖尿病大血管病變及吡格列酮保護血管內(nèi)皮功能的新機制，為糖尿病血管并發(fā)癥的防治提供新的思路。

材 料 和 方 法

1材料

1.1藥物與試劑 RPMI-1640 培養(yǎng)基購自Gibco；小牛血清、胎牛血清購自杭州四季青公司；瓊脂糖購自Amresco；胰酶購自 Difcd；FITC-羊抗鼠Ⅱ抗購自Immunotech； Trizol 購自Invitrogen；DEPC購自BBI； M-MLV、隨機引物和 dNTP購自Promega；RNA 酶抑制劑(RNasin)購自上海華美生物技術(shù)公司；Taq 酶購自上海晶美生物工程有限公司；D-葡萄糖為國產(chǎn)分析純； HUVECs(ECV304)為蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院血栓與止血研究室凍存細(xì)胞株；鼠抗人 EPCR 多克隆抗體由王迎春教授惠贈；吡格列酮儲存液由蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科王育林博士惠贈。鼠抗人單克隆β-actin 購自 Sigma。

1.2主要儀器 Ex TaqTMR-PCR Version 2.1 購自大連寶生物公司；Eva Green 購自Biotium；流式細(xì)胞儀 Cytomics FC500 購自 Beckman Coulter；實時定量(real-time) PCR 儀 MJ Research Opticon2TM購自MJ Research；PCR 引物由上海生物工程有限公司合成。

2方法

2.1HUVECs的培養(yǎng) 復(fù)蘇HUVECs細(xì)胞，用含 15%小牛血清的 RPMI-1640 培養(yǎng)基在 37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。2～3 d換液1次，并按合適密度傳代。將HUVECs細(xì)胞以 1×108/L密度接種于 6 孔板中，用含 15%小牛血清的 RPMI-1640 培養(yǎng)基在 37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng) 24 h，在高倍顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞貼壁生長，并有 80%～90%融合。再用無血清的 RPMI-1640 培養(yǎng)基替換完全培養(yǎng)基，37℃、5% CO2條件下孵育過夜。

2.2實驗分組 實驗一 ： HUVECs細(xì)胞用含D-葡萄糖的低血清(含 3%小牛血清)RPMI-1640 培養(yǎng)基培養(yǎng) 24 h，觀察不同D-葡萄糖濃度(5 mmol/L 、10 mmol/L、30 mmol/L、50 mmol/L)時 EPCR mRNA 的表達(dá)；同時以 D-葡萄糖濃度為 50 mmol/L 的低血清(含 3%小牛血清)RPMI-1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)HUVECs細(xì)胞，觀察不同時點(0.5 h、3 h、6 h、12 h、24 h)時 EPCR mRNA 的表達(dá)。以相同時間的不加刺激劑組為對照。實驗二： HUVECs細(xì)胞先以含不同濃度(5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L)吡格列酮的低血清(含 3%小牛血清)RPMI-1640 培養(yǎng)基培養(yǎng) 6 h，然后置于含 50 mmol/L葡萄糖的新鮮低血清(含 3%小牛血清)RPMI-1640 培養(yǎng)基中孵育至 24 h。同時以相同時間的不加刺激劑組為空白對照，以相同時間含 50 mmol/L 葡萄糖的低血清(含 3%小牛血清)RPMI-1640 培養(yǎng)基培養(yǎng) 24 h 組為陽性對照。每個實驗組設(shè) 5 復(fù)孔，每次實驗重復(fù) 3 次。

2.3流式細(xì)胞儀檢測EPCR在HUVECs細(xì)胞的表達(dá) 采用流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測HUVECs細(xì)胞膜上 EPCR 的表達(dá)。生長至 80%融合的細(xì)胞以 0.25%胰酶消化，收集細(xì)胞，保證細(xì)胞數(shù)達(dá)到 1×109/L，1×PBS 洗滌3次；每管加 200 μL 1×PBS，重懸；均勻分成2管，其中一管加入 20 μL 鼠抗人 EPCR Ⅰ抗(1 μg∶20 μL)，另一管加入 20 μL 1×PBS 作為空白對照；4 ℃ 濕盒中反應(yīng) 1 h；離心、棄上清，1×PBS 洗滌3次，每管加 250 μL 1×PBS，重懸；每管加入 10 μL FITC-羊抗鼠Ⅱ抗(1 μg∶10 μL)，黑暗處反應(yīng) 30 min；離心、棄上清，1×PBS 洗滌3次，每管加 250 μL 1×PBS，重懸；流式細(xì)胞儀上檢測。

2.4采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)和實時定量PCR(real-time quantitative PCR)技術(shù)檢測EPCR mRNA的表達(dá)。

2.4.1總RNA抽提 利用Trizol試劑從各組HUVECs中提取總RNA，紫外分光光度計測定A260/A280為1.8～2.2，并將 mRNA 濃度調(diào)整至 0.5 g/L。

2.4.2逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 取mRNA 3 μg，隨機引物 2 μL，加 DEPC 水補足反應(yīng)總體積至 15 μL，65 ℃ 變性 5 min 后立即冰??；加 M-MLV 1 μL、 緩沖液 8 μL 、RNasin 0.5 μL 和 dNTP 1.25 U，加 DEPC 水補足反應(yīng)總體積至 25 μL，37 ℃ 1 h 后，95 ℃ 5 min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。

2.4.3聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR) β-actin上游引物5’-CTCGCGCTACTCTCTCTTTC-3’，下游引物5’-CAGTCTCGATCCCACTTAA-3’，擴增片段330 bp。EPCR 上游引物 5’-ATTGCTGCCGATACTGCT-3’，下游引物5’-AGAGGAAAGGCCAAGGTC-3’，擴增片段318 bp。以上序列由上海生物工程有限公司合成。以β-actin(330 bp)作內(nèi)參照。反應(yīng)條件：EPCR為 94 ℃ 4 min 后開始循環(huán)，94 ℃ 40 s→58 ℃ 40 s→72 ℃ 40 s，共 30 個循環(huán)，最后72 ℃ 10 min；β-actin 為 94 ℃ 4 min 后開始循環(huán)，94 ℃ 40 s→58 ℃ 40 s→72 ℃ 40 s，共 28 個循環(huán)，最后 72 ℃ 10 min。反應(yīng)后 1.5%瓊脂糖凝膠上樣，電泳鑒定結(jié)果。

2.4.4實時定量PCR 反應(yīng)體系：5×buffer 5 μL，Mg2+(250 mmol/L)0.25 μL，dNTP(10 mmol/L)0.75 μL，Taq酶(250 U∶50 μL) 0.25 μL，上游引物(10 mmol/L) 0.5 μL，下游引物 (10 mmol/L) 0.5 μL，Evagreen(10 mmol/L) 0.5 μL，雙蒸水 15.45 μL，cDNA 2 μL，共 25 μL 體系；反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min 預(yù)變性，95 ℃ 15 s→58 ℃ 25 s→72 ℃ 25 s→78 ℃ 0.1 s；讀板；50 個循環(huán)；60 ℃～96 ℃ 0.3 s 熔解曲線；72 ℃ 5 min；4 ℃，forever。結(jié)果計算公式：(1)相對量=2-ΔCt，ΔCt=目的基因 Ct-內(nèi)參基因 Ct;(2)實驗組∶對照組的相對量=2-ΔΔCt，ΔΔCt=實驗組ΔCt-對照組ΔCt。

3統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果

EPCR在HUVECs表面高表達(dá)，為96.5%，見圖1。

Figure 1. The expression of EPCR protein in HUVECs was confirmed by flow cytometry. A: HUVECs control, treated with PBS; B: HUVECs test, treated with mouse anti-human EPCR antibody.

圖1流式細(xì)胞術(shù)檢測EPCR在HUVECs表面的表達(dá)

2RT-PCR結(jié)果

RT-PCR結(jié)果顯示HUVECs細(xì)胞膜上有較高的EPCR mRNA表達(dá)，見圖2。

Figure 2. The expression of EPCR mRNA in HUVECs was confirmed by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) technique. M：marker；EPCR：318 bp；β-actin：330 bp.

圖2HUVECs細(xì)胞EPCRmRNA的表達(dá)

3D-葡萄糖和吡格列酮對HUVECs細(xì)胞EPCRmRNA表達(dá)的影響

3.1相同時間不同濃度D-葡萄糖對HUVECs EPCR mRNA的影響 已80%融合的HUVECs細(xì)胞中加入D-葡萄糖使其濃度分別達(dá)5 mmol/L、10 mmol/L、30 mmol/L和50 mmol/L，以低血清(含 3%小牛血清)RPMI-1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)HUVECs細(xì)胞為空白對照。24h后EPCR mRNA水平分別是空白對照組(100%)的(93.58±0.96)%(P>0.05)、(91.42±0.13)%(P>0.05)、(85.14±0.56)%(P<0.05)和(65.02±0.62)%(P<0.01)，高糖明顯下調(diào)HUVECs細(xì)胞EPCR mRNA的表達(dá)(P<0.05)。EPCR mRNA 的表達(dá)隨加入D- 葡萄糖濃度的增加而逐漸減少，在 D- 葡萄糖濃度為30 mmol/L和50 mmol/L時EPCR mRNA的表達(dá)呈顯著下降(P<0.05)，并呈劑量依賴性，見圖3。

3.2相同濃度D-葡萄糖不同時間培養(yǎng)HUVECs對EPCR mRNA的影響 加入50 mmol/L D-葡萄糖分別培養(yǎng)HUVECs細(xì)胞0.5 h、3 h、6 h、12 h和24 h。與空白對照組(100%)相比，0.5 h、3 h和6 h時EPCR mRNA水平分別為(95.68±0.76)%、(95.62±0.56)%和(92.58±0.58)%，但與對照組相比無顯著差異(P>0.05)；12 h和24 h時EPCR mRNA水平分別為(82.96±0.89)%(P<0.05)和(64.78±0.86)%(P<0.01)，D-葡萄糖對EPCR mRNA表達(dá)的影響呈時間依賴性，見圖4。

圖3不同濃度D-葡萄糖對EPCRmRNA表達(dá)的影響

圖4不同時間相同濃度D-葡萄糖對EPCRmRNA表達(dá)的影響

3.3不同濃度吡格列酮預(yù)處理對HUVECs EPCR mRNA表達(dá)的影響 HUVECs細(xì)胞生長至80%融合后分為5組，分別為低血清(含 3%小牛血清)RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)的空白對照組、僅加50 mmol/L D-葡萄糖的陽性對照組和以不同濃度吡格列酮(5 μmol/L、10 μmol/L及20 μmol/L)預(yù)處理的實驗組。實驗組加入不同濃度吡格列酮預(yù)作用6 h，然后換新鮮的含50 mmol/L D-葡萄糖的培養(yǎng)基孵育至24 h。其中以空白對照組EPCR mRNA的表達(dá)設(shè)為100%，陽性對照組EPCR mRNA的表達(dá)為(65.50±0.81)%，不同吡格列酮濃度(5 μmol/L、10 μmol/L和20 μmol/L)預(yù)處理后其EPCR mRNA的表達(dá)分別為(72.82±0.46)%、(76.60±1.59)%和(82.60±0.57)%(與對照組比)。高糖刺激下HUVECs細(xì)胞EPCR mRNA表達(dá)明顯降低，適宜濃度的吡格列酮預(yù)處理HUVECs細(xì)胞能顯著改善高糖對EPCR mRNA表達(dá)的下調(diào)作用(P<0.05)，見圖5。

圖5不同濃度吡格列酮干預(yù)對EPCRmRNA表達(dá)的影響

討 論

高血糖是糖尿病的主要代謝特征，國內(nèi)外的研究均已證實高血糖可直接或間接損傷內(nèi)皮細(xì)胞功能，促進炎癥反應(yīng)及血栓形成，參與糖尿病血管并發(fā)癥發(fā)生和發(fā)展的進程。

EPCR 是近年發(fā)現(xiàn)的PC系統(tǒng)的一個新成員，是一個由 221 個氨基酸組成的Ⅰ型跨膜糖蛋白，主要表達(dá)于大血管內(nèi)皮細(xì)胞，其通過凝血酶(thrombin)-凝血酶調(diào)節(jié)蛋白(thrombomodulin,TM)復(fù)合物增進PC活性，提高PC的活化率。活化蛋白 C(the activated protein C，APC)在蛋白S、膜磷脂、Ⅴ因子及鈣離子等輔因子參與下，滅活 FVa 和Ⅷa，發(fā)揮抗凝作用[6]。另外，APC的抗炎作用也是近年來研究的熱點。其可能主要通過以下機制實現(xiàn)抗炎作用：首先，APC可直接作用于內(nèi)皮細(xì)胞，通過下調(diào) NF-κB的2個亞基(P50 和P52)的表達(dá)而下調(diào)下游基因的腫瘤壞死因子的表達(dá)；其次，其還能下調(diào)黏附分子ICAM-1、VCAM-1和E-選擇素的表達(dá)；同時，APC 還能直接上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞bcl-2等抗凋亡基因的表達(dá)[7]。而所有這些分子機制的進程，均需要EPCR作為輔因子參與[3]。同時，新近的研究也表明EPCR對炎癥導(dǎo)致的內(nèi)皮損傷具有直接的保護作用。Taylor等[8]已證明，EPCR能介導(dǎo)APC保護狒狒，使之抵抗因大腸桿菌輸入引起的致死作用。EPCR也可以直接抑制病原體介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)[9]。

綜上所述，EPCR可通過與PC/APC特異性結(jié)合發(fā)揮抗凝及抗炎作用，對維持血管內(nèi)皮功能起著至關(guān)重要的作用。因此，EPCR也有可能參與高糖損傷內(nèi)皮細(xì)胞的進程。

目前，高血糖損傷內(nèi)皮細(xì)胞功能機制的研究主要集中在如下幾個方面：(1)多元醇途徑活性增強，導(dǎo)致細(xì)胞生長必需的肌醇減少及胞內(nèi)山梨醇聚集以及高滲透壓而損傷內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cells，ECs)； (2)非酶糖基化及糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)的形成，AGEs引起ECs增殖異常，并促進ECs死亡；(3)高糖狀態(tài)下產(chǎn)生過多的氧自由基，其對ECs產(chǎn)生嚴(yán)重的毒害作用[10]?，F(xiàn)有研究已表明EPCR在維持血管內(nèi)皮細(xì)胞功能中發(fā)揮重要的作用，但目前關(guān)于高血糖是否通過EPCR損傷內(nèi)皮細(xì)胞功能國內(nèi)外還未見相關(guān)報道。

本研究通過體外培養(yǎng)HUVECs，采用定量 real-time PCR 技術(shù)測定 HUVECs EPCR mRNA 的表達(dá)水平，證實在HUVECs細(xì)胞膜上有較高的EPCR mRNA表達(dá)，并且在高糖條件下培養(yǎng)的HUVECs，其 EPCR mRNA 的表達(dá)明顯下降，這表明高糖可通過下調(diào)EPCR mRNA的表達(dá)而導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能受損，這可能是糖尿病并發(fā)血管病變的新機制之一。

吡格列酮(troglizone)是一種噻唑烷二酮(thiazolidinedione,TZD) 類降血糖藥物，其可以通過改善胰島素抵抗，促進靶組織肌肉、肝臟、脂肪組織中糖的轉(zhuǎn)運及脂肪分解，達(dá)到降低血糖的目的[11]。新近的研究顯示，TZDs不但可以改善胰島素抵抗，降低血糖，還可以直接通過抑制炎癥反應(yīng)、保護內(nèi)皮功能等非降糖途徑來發(fā)揮血管保護作用[12-13]。近年來的研究也表明吡格列酮通過保護內(nèi)皮細(xì)胞功能而延緩動脈粥樣硬化的早期進程[14]。然而，目前關(guān)于吡格列酮保護內(nèi)皮細(xì)胞功能的機制還不十分明確，其是否可通過上調(diào)EPCR的表達(dá)來發(fā)揮其保護內(nèi)皮細(xì)胞功能作用的研究還未見相關(guān)報道。

本研究發(fā)現(xiàn)在適量濃度的吡格列酮預(yù)處理HUVECs后，能明顯改善高糖所致的HUVECs EPCR mRNA表達(dá)的下調(diào)。這表明吡格列酮在高糖環(huán)境下能上調(diào)EPCR mRNA的表達(dá)而拮抗高糖對HUVECs內(nèi)皮功能的損傷，實現(xiàn)其血管保護作用。這可能對今后 DM 血管并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展的機制研究及靶向治療具有重要意義。

綜上所述，高血糖可通過下調(diào)EPCR mRNA的表達(dá)而損傷內(nèi)皮細(xì)胞功能，而吡格列酮能通過改善高血糖導(dǎo)致的EPCR mRNA下調(diào)而發(fā)揮保護內(nèi)皮細(xì)胞功能的作用，這可能是吡格列酮預(yù)防糖尿病血管并發(fā)癥的新機制。

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EffectsofglucoseandpioglitazoneonexpressionofendothelialproteinCreceptorinhumanumbilicalveinendothelialcells

GUO Xiao-fang1,3, LIU Hai-bo2, REN Hui-long1, CHEN Hong-wei1, LAI Jing-bo1, GONG Wei-kun1, CHENG Xing-bo3, LU Guo-yuan4

(1DepartmentofEndocrinology,2DepartmentofCardiology,YinzhouPeople’sHospital,Ningbo315040,China;3DepartmentofEndocrinology,4DepartmentofNephrology,theFirstAffiliatedHospitalofSoochowUniversity,Suzhou215006,China.E-mail:liuhaibo79@eyou.com)

AIM: To investigate the effects of glucose and pioglitazone on the expression of endothelial protein C receptor (EPCR) in human umbilical vein endothelial cells (HUVECs).METHODSCultured HUVECs were used as target cells. The expression of EPCR in HUVECs at mRNA and protein levels was confirmed by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) and flow cytometry, respectively. Different concentrations of glucose were added to the culture medium to establish the injury model of HUVECs. Pioglitazone was also added to the culture medium to observe the reversible influence. The mRNA levels of EPCR were measured by real-time quantitative PCR.RESULTSThe expression of EPCR in HUVECs was down-regulated by hyperglycemia in a dose-and time-dependent manner. Pioglitazone reversed the down-regulation of the mRNA expression of EPCR by hyperglycemia in HUVECs.CONCLUSIONHUVECs express EPCR mRNA at a high level. Hyperglycemia damages the function of endothelial cells by down-regulating the expression of EPCR. Pioglitazone attenuates the injury of HUVECs induced by hyperglycemia.

Endothelial cells; Glucose; Pioglitazone; Endothelial protein C receptor

R589.9

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.09.006