劉濤 王統(tǒng)玲 勾善淼 殷濤 汪理 周偉 李永峰 王春友

·論著·

胰島素對人胰腺癌PANC1細(xì)胞增殖與侵襲能力的影響

劉濤 王統(tǒng)玲 勾善淼 殷濤 汪理 周偉 李永峰 王春友

目的研究胰島素對人胰腺癌PANC1細(xì)胞增殖、侵襲能力及細(xì)胞低氧誘導(dǎo)因子(HIF-1α)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達(dá)的影響。方法采用0.1、1、10、100 nmol/L胰島素處理PANC1。噻唑藍(lán)法和Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖和侵襲能力；蛋白質(zhì)印跡法和實(shí)時(shí)PCR法檢測增殖性細(xì)胞核抗原(PCNA)及HIF-1α、VEGF蛋白和mRNA的表達(dá)。結(jié)果胰島素呈劑量依賴性誘導(dǎo)PANC1細(xì)胞的增殖，上調(diào)HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)。100 nmol/L胰島素干預(yù)4 d，PANC1細(xì)胞的PCNA蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(1.196±0.014比1.157±0.013，P<0.05)；Transwell小室穿膜細(xì)胞數(shù)量顯著增加[(141.0±2.1)個(gè)比(89.0±1.4)個(gè)，P<0.05]；HIF-1α蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(1.139±0.020比0.598±0.013，P<0.05)，但HIF-1α mRNA表達(dá)無明顯變化；VEGF蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(1.011±0.023比0.627±0.013，P>0.05)，VEGF mRNA表達(dá)亦顯著上調(diào)(0.970±0.016比0.350±0.013，P<0.05)。結(jié)論高胰島素微環(huán)境可誘導(dǎo)PANC1細(xì)胞增殖，并通過上調(diào)HIF-1α及VEGF的表達(dá)增強(qiáng)細(xì)胞的侵襲能力。

胰腺腫瘤； 胰島素； 增殖； 侵襲； 微環(huán)境

胰腺內(nèi)、外分泌部結(jié)構(gòu)關(guān)系緊密，血流經(jīng)胰島到達(dá)外分泌部，胰島分泌的胰島素、胰高血糖素、生長抑素等透過管壁到達(dá)腺泡細(xì)胞間液營養(yǎng)外分泌細(xì)胞[1]。局部組織的胰島內(nèi)分泌激素濃度高于體循環(huán)[2]，形成了胰腺癌特有的微環(huán)境。研究顯示，局部高胰島素微環(huán)境可能促進(jìn)胰腺癌局部生長與浸潤[3]。本實(shí)驗(yàn)觀察胰島素對人胰腺癌細(xì)胞PANC1增殖、侵襲能力及低氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達(dá)的影響。

材料與方法

一、細(xì)胞培養(yǎng)

PANC1細(xì)胞由協(xié)和醫(yī)院普通外科實(shí)驗(yàn)室提供，常規(guī)培養(yǎng)、傳代。取對數(shù)生長期細(xì)胞，按每孔1000個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)液中加入終濃度為0.1、1、10、100 nmol/L的胰島素(Sigma公司)，以不加胰島素為對照。每2 d換液。每隔24 h每孔加入噻唑藍(lán)20 μl培養(yǎng)4 h，再加150 μl二甲亞砜溶解的甲瓚，測每孔490 nm處吸光值(A490)。每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔，連測7 d。以細(xì)胞生長時(shí)間為橫軸，A490值為縱軸繪制生長曲線。

二、Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)

在Transwell小室(BD公司)上室加入1×105個(gè)100 nmol/L胰島素處理的細(xì)胞或?qū)φ战M細(xì)胞。下室加入500 μl含血清的培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)24 h，擦去上室面細(xì)胞，HE染色，鏡下選擇中央及四周5個(gè)視野，計(jì)膜下室面細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

三、蛋白質(zhì)印跡法

取0、0.1、1、10、100 nmol/L胰島素處理4 h及100 nmol/L胰島素處理0、2、4、8、12、24 h的PANC1細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，常規(guī)行蛋白質(zhì)印跡法檢測增殖性細(xì)胞核抗原(PCNA)、HIF-1α、VEGF蛋白的表達(dá)，以GAPDH作為內(nèi)參。兔抗人PCNA一抗購于Thermo公司，兔抗人HIF-1α、VEGF和GAPDH一抗均購于Santa Cruz公司。以目的蛋白與內(nèi)參條帶的灰度比值表示蛋白表達(dá)量。

四、實(shí)時(shí)PCR法

取100 nmol/L胰島素處理4 h的PANC1細(xì)胞，用Trizol提取細(xì)胞總RNA。先逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后行實(shí)時(shí)定量PCR。HIF-1α引物上游5′-TGAAGTGTACCCTAACTAGCCG-3′，下游5′-AATCAGCACCAAGCAGGTCATAG-3′，片段158 bp；VEGF引物上游5′-GAGGGCAGAATCATCACGAAG-3′，下游5′-AGGGAACGCTCCAGGACTTAT-3′，片段402 bp；內(nèi)參β-actin引物上游5′-AAGGCCAGGTAATTGTCACG-3′，下游5′-AGCAGC TCTGCAGTACGTC-3′，片段105 bp。引物均由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。PCR反應(yīng)條件：94℃ 3 min，94℃ 30 s、57℃ 30 s、72℃ 30 s，45個(gè)循環(huán)。獲取各組標(biāo)本的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算機(jī)分析Ct值，待測樣品mRNA表達(dá)量=2-△△Ct，△△Ct=(△Ct內(nèi)參-△Ct樣品)。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、胰島素對PANC1增殖能力的影響

胰島素呈劑量依賴性誘導(dǎo)細(xì)胞的增殖(圖1)。100 nmol/L胰島素干預(yù)1、2、4 d后，細(xì)胞PCNA蛋白的表達(dá)量為0.977±0.009、1.155±0.013、1.196±0.014，較對照組0.891±0.010、1.101±0.012、1.157±0.013的表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.05，圖2)。

圖1 不同濃度胰島素對PANC1生長的影響

圖2胰島素干預(yù)組(a)和對照組(b)細(xì)胞的PCNA蛋白表達(dá)

二、胰島素對PANC1侵襲能力的影響

對照組穿膜細(xì)胞數(shù)為(89.0±1.4)個(gè)，100 nmol/L胰島素處理組為(141.0±2.1)個(gè)(圖3)，兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖3胰島素干預(yù)組(a)和對照組(b)的穿膜細(xì)胞(HE ×100)

三、PANC1細(xì)胞HIF-1α 、VEGF蛋白表達(dá)變化

0.1、1、10、100 nmol/L胰島素處理4 h后，細(xì)胞HIF-1α蛋白表達(dá)量分別為0.958±0.018、0.996±0.011、1.116±0.011、1.147±0.016，呈劑量依賴性，均較對照組的0.617±0.009顯著上調(diào)(P值均<0.05)；VEGF蛋白表達(dá)量為0.945±0.016、0.981±0.011、1.106±0.012、1.120±0.010，呈劑量依賴性，亦均較對照組的0.789±0.012顯著上調(diào)(圖4a，P值均<0.05)。100 nmol/L胰島素處理2、4、8、12、24 h后，細(xì)胞HIF-1α蛋白表達(dá)量分別為0.891±0.018、1.139±0.020、1.101±0.016、0.874±0.014、0.615±0.011，除24 h點(diǎn)外均較對照組的0.598±0.013顯著上調(diào)(P值均<0.05)；VEGF表達(dá)量分別為0.917±0.019、1.011±0.023、1.118±0.020、1.157±0.018、1.162±0.016，均較對照組的0.627±0.013顯著上調(diào)(圖4b，P值均<0.05)。

圖4不同濃度胰島素干預(yù)4 h和100 nmol/L胰島素干預(yù)不同時(shí)間的PANC1細(xì)胞的HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)

四、PANC1細(xì)胞HIF-1α 、VEGF mRNA表達(dá)變化

100 nmol/L胰島素處理4 h后，細(xì)胞HIF-1α mRNA表達(dá)量為0.910±0.012，與對照組的0.880±0.011無顯著差異；VEGF mRNA表達(dá)量為0.970±0.016，較對照組的0.350±0.013顯著上調(diào)(P<0.05)。

討 論

流行病學(xué)調(diào)查顯示，2型糖尿病是胰腺癌的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，伴2型糖尿病的胰腺癌患者體內(nèi)胰島素水平升高，可能影響胰腺癌的惡性生物學(xué)行為[4]。此外，胰腺癌細(xì)胞表達(dá)胰島素受體[5]，胰腺癌組織中散在分布內(nèi)分泌細(xì)胞[6]。Wang等[7]將鼠胰島細(xì)胞與人胰腺癌細(xì)胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液中存在高濃度胰島素，促進(jìn)癌細(xì)胞生長和對葡萄糖的利用。但胰高血糖素與生長抑素?zé)o此作用[8]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，胰島素以劑量依賴性方式促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞增殖，且明顯促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。

胰腺癌組織HIF-1α高表達(dá)，與胰腺癌的惡性生物學(xué)行為相關(guān)[9]；胰島素可與低氧協(xié)同誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞HIF-1α表達(dá)，增加腫瘤細(xì)胞對葡萄糖的利用[1]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，常氧條件下胰島素明顯誘導(dǎo)HIF-1α、VEGF表達(dá)上調(diào)，但24 h時(shí)HIF-1α表達(dá)恢復(fù)到處理前水平，考慮是胰島素耗盡后HIF-1α在常氧下被降解所致。然而，胰島素并不能影響HIF-1α mRNA的表達(dá)，卻能誘導(dǎo)VEGF mRNA表達(dá)，提示胰島素對HIF-1α的調(diào)控處于翻譯后水平，對VEGF的調(diào)控處于轉(zhuǎn)錄水平。

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EffectsofinsulinonproliferationandinvasionofhumanpancreaticcancerPANC1cells

LIUTao,WANGTong-ling,GOUShan-miao,YINTao,WANGLi,ZHOUWei,LIYong-feng,WANGChun-you.
DepartmentofPancreaticSurgery,UnionHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430022,China

WANGChun-you,Email:chunyouwang@mail.hust.edu.cn

ObjectiveTo investigate the effects of insulin on the proliferation and invasion of human pancreatic cancer cells PANC1, and on its HIF-1α, VEGF expression.MethodsPANC1 was pretreated with insulin of different concentrations (0.1, 1, 10, 100 nmol/L). The proliferation of PANC1 was tested by MTT method, and transwell assay was used to test the invasion ability of PANC1. HIF-1α, VEGF and PCNA protein expression was assessed by Western blots, and HIF-1α, VEGF mRNA was detected by real-time PCR.ResultsInsulin could increase the proliferation of PANC1 in a dose-dependent manner (p<0.05), and increase the expression of HIF-1α, VEGF protein. After 100 nmol/L insulin treatment for 4 d, the PCNA protein expression in the insulin group was significantly higher than that in the control group (1.196±0.014vs1.157±0.013,P<0.05). The cancer cells passed through the chamber in insulin group were much more than that in the control group (141.0±2.1vs89.0±1.4,P<0.05). The expression of HIF-1α protein was significantly increased (1.139±0.020vs0.598±0.013,P<0.05), while there was no significant change of HIF-1α mRNA expression. Both the expression of VEGF protein and mRNA were significantly increased (1.011±0.023vs0.627±0.013 0.970±0.016vs0.350±0.013,P<0.05).ConclusionsHigh insulin microenvironment could enhance the proliferation and invasion of PANC1 cells by up-regulating the expression of HIF-1α and VEGF.

Pancreatic neoplasms； Insulin； Proliferation； Invasion； Microenvironment

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.01.007

國家自然科學(xué)基金(30801098)

430022 湖北武漢，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院胰腺外科

王春友，Email:chunyouwang@mail.hust.edu.cn

2011-04-07)

(本文編輯：呂芳萍)