胡金樹，于慶杰，朱一堂，丁繼生

（滄州市中心醫(yī)院 檢 驗(yàn)科，河北 滄 州061001）

細(xì)菌生物被膜是發(fā)生呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎的重要原因，在對(duì)生物被膜的研究中很多物質(zhì)能抑制生物被膜，但增加了細(xì)菌的耐藥性，本文主要研究殼聚糖對(duì)大腸埃希菌生物被膜的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 實(shí)驗(yàn)菌株：臨床標(biāo)本中分離，經(jīng)API20E鑒定的大腸埃希菌；藥敏質(zhì)控菌株ATCC25922，肺炎克雷伯菌ATCC700603、陰溝腸桿菌029M購(gòu)自衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心。

1.1.2 材料和儀器 殼聚糖：分子量30萬(wàn)，脫乙酰度大于85%，浙江金殼生物化學(xué)有限公司；氣管導(dǎo)管規(guī)格8.0 mm，廣州韋士泰醫(yī)療器械有限公司。

藥敏紙片：OXIOD公司，分別是哌拉西林／他唑巴坦（TZP）、左氧沙星（LEV）、亞胺培南（IPM）、慶大霉素（CN）、阿米卡星（AK）、頭孢曲松（CRO）、頭孢噻肟（CTX）、頭孢他啶（CAZ）、頭孢呋新（CXM）、阿莫西林／棒（AMC）、頭孢西?。‵OX）、頭孢噻肟／克拉維酸 （CTX／CLAX）、頭孢他啶／克 拉 維 酸（CAZ／CLAV）。

儀器：掃描電子顯微鏡：日本電子JSM－5600LV型。

1.2 方法

1.2.1 大腸埃希菌生物被膜模型的培養(yǎng) 稱量殼聚糖適量放入3%乙酸溶液10 ml中浸泡后，加入適量甘油和無(wú)水乙醇攪拌均勻，在導(dǎo)管內(nèi)壁涂層，自然干燥后放入10%NaOH溶液中固定20 min，用蒸餾水沖洗至中性。取新鮮菌落放入生理鹽水，調(diào)至吸光度為0.145，以此作為菌懸液。按文獻(xiàn)方法［1］并改良。吸取0.1 ml菌懸液種入含有4.9 ml生理鹽水及1 cm長(zhǎng)導(dǎo)管的無(wú)菌杯中（導(dǎo)管水平放置），36℃培養(yǎng)，隔日更換液體，培養(yǎng)7 d得到BF。7天后，將導(dǎo)管的外壁用酒精紗布反復(fù)擦拭，生理鹽水反復(fù)沖洗其內(nèi)壁、外壁和套囊孔，以去除未粘附細(xì)菌及殘余酒精。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 空白組為浮游菌組，對(duì)照組為由空白導(dǎo)管制備的生物被膜組，實(shí)驗(yàn)組為包被分子量30萬(wàn)殼聚糖的導(dǎo)管制備的生物被膜組，每組標(biāo)本為12例。

1.2.3 掃描電鏡觀察對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組

1.2.4 酶的檢測(cè)和細(xì)菌藥敏 ESBLs的檢測(cè)，CTX、CTX／CLAX 及 CAZ、CAZ／CLAV 中任何1對(duì)紙片抑菌環(huán)直徑差≥5 mm時(shí)，判斷為ESBLs陽(yáng)性株。肺炎克雷伯ATCC700603作為陽(yáng)性對(duì)照。Amp C的檢測(cè)，先用FOX檢測(cè)，抑菌環(huán)直徑≤18 mm的菌株，若FEP、TPM 表現(xiàn)為敏感，而CTX、CTX／CLAX 和 CAZ／CLAV 表現(xiàn)為耐藥，或在CTX、CTX／CLAX和CAZ／CLAV的抑菌環(huán)內(nèi)存在散在的菌落，判斷為Amp C陽(yáng)性。陰溝腸桿菌029M作為AmpC酶陽(yáng)性對(duì)照，肺炎克雷伯ATCC700603作為Amp C酶陰性對(duì)照。藥敏采用KB法，判斷標(biāo)準(zhǔn)以CLSI為準(zhǔn)則。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)方法 兩組之間各酶的檢出率進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，設(shè)P＜0.05有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的電鏡照片 圖中對(duì)照組細(xì)菌數(shù)量明顯比實(shí)驗(yàn)組多，不但證明該方法能夠形成生物被膜，還證明30萬(wàn)分子量的殼聚糖能抑制大腸埃希菌的生物被膜。

表1 各組酶的檢出結(jié)果（菌株／檢出率%，n＝12）

圖1 各實(shí)驗(yàn)組的電鏡照片

2.2 藥敏結(jié)果 各組對(duì)亞胺培南的耐藥率最低，其次是對(duì)加酶抑制劑的抗生素耐藥率較低，對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組對(duì)抗生素的耐藥性高于空白組。整個(gè)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各組的藥敏率（菌株／耐藥率%）

隨著對(duì)生物被膜的研究，發(fā)現(xiàn)了許多物質(zhì)對(duì)其有抑制作用，但有的增加了耐藥性［2］、對(duì)人體毒性［3］等副作用。殼聚糖是不但對(duì)人體細(xì)胞無(wú)毒［4］，而且能夠抑制生物被膜的形成［5］。

本實(shí)驗(yàn)首次選用大腸埃希菌來(lái)研究殼聚糖對(duì)生物被膜細(xì)菌耐藥性的影響。耐藥性的比較以ESBLs和AmpC來(lái)研究。ESBLs由質(zhì)粒介導(dǎo)，可通過(guò)接合、轉(zhuǎn)化和傳導(dǎo)等方式在細(xì)菌種屬之間進(jìn)行傳遞。Amp C酶是指由革蘭陰性桿菌產(chǎn)生的不被克拉維酸抑制的“絲氨酸”頭孢菌素酶組成的一個(gè)酶家簇。

結(jié)果表明生物被膜兩組ESBLs和Amp C酶的檢出率均明顯高于浮游組各酶的檢出率。其中原因可能為BF的細(xì)菌無(wú)論在形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理生化特性及致病特點(diǎn)等都與浮游生長(zhǎng)的細(xì)菌顯著不同，開啟了耐藥基因，具有很強(qiáng)的耐藥性［6］。由于BF的形成，促進(jìn)了AmpC和ESBLs的產(chǎn)生，而這兩種酶同時(shí)存在又增加了耐藥性，但是亞胺培南的抗菌活性最高，無(wú)耐藥菌株。從藥敏結(jié)果來(lái)看，對(duì)其他抗生素的耐藥性較高，可知，對(duì)于該菌感染一定要在藥敏實(shí)驗(yàn)的指導(dǎo)下進(jìn)行治療。對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的耐藥性沒(méi)有差異，殼聚糖沒(méi)有影響生物被膜細(xì)菌的耐藥性，可能是殼聚糖殺滅細(xì)菌的機(jī)理是進(jìn)入細(xì)菌干擾其帶負(fù)電荷的遺傳物質(zhì)DNA和RNA，抑制細(xì)菌的繁殖，是一種物理的靜電吸引作用，不同于常規(guī)的化學(xué)藥物［7］。

綜上所述殼聚糖既對(duì)人體無(wú)毒無(wú)害、可抑制生物被摸的形成，又未增加細(xì)菌的耐藥性，在醫(yī)學(xué)有潛在價(jià)值。

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［3］Nagamune H，Maeda T，Ohkura K，et al.Evaluation of the cytotoxic effects of Bisquaternary ammonium antimicro－bial reagents on human cells［J］.Toxicol in Vitro，2000，14（2）：139.

［4］Enríquez de Salamanca A，Diebold Y，Calonge M，et al.Chitosan nanoparticles as a potential drug delivery system for the ocular surface：toxicity，uptake mechanism and in vivo tolerance［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2006 ，47（4）：1416.

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