劉繼華 楊繼先 解書潤 吳小鳳

湖北省恩施土家族苗族自治州疾病預(yù)防控制中心，湖北恩施 445000

恩施州部分傷寒沙門氏菌分離鑒定和基因分型結(jié)果分析

劉繼華 楊繼先 解書潤 吳小鳳

湖北省恩施土家族苗族自治州疾病預(yù)防控制中心，湖北恩施 445000

目的 對兩起由傷寒沙門氏菌引起的聚集性爆發(fā)流行中所分離到的傷寒沙門氏菌進(jìn)行鑒定和基因分型，探討恩施州傷寒沙門菌的分子流行病學(xué)，為科學(xué)防治提供依據(jù)。 方法 用傳統(tǒng)方法對11株傷寒沙門氏菌菌株進(jìn)行生化、血清學(xué)復(fù)核鑒定。對確認(rèn)的傷寒沙門氏菌菌株，采用脈沖場凝膠電泳技術(shù)分析電泳酶切指紋圖譜。 結(jié)果 11株傷寒沙門菌經(jīng)PFGE，根據(jù)其條帶的差異可分為3個PFGE型別。 結(jié)論 兩起傷寒沙門氏菌感染為不同亞型所致。

脈沖場凝膠電泳；傷寒沙門氏菌；基因分型

2010年12月～2011年4月，恩施州兩所中學(xué)連續(xù)發(fā)生兩起經(jīng)證實由傷寒沙門氏菌引起的聚集性爆發(fā)流行?；颈葘Ψ椒ㄔ趥魅静〔≡粉櫻芯恐凶C實了其實用性和科學(xué)性，并在霍亂弧菌毒力基因和基因分型研究中取得了可證實的作用[1]。為了解這兩起傷寒沙門氏菌引起的疫情的內(nèi)在聯(lián)系，在湖北省預(yù)防科學(xué)院有關(guān)專家的支持下，采用脈沖場電泳基因分離檢測技術(shù)對兩起疫情的病原進(jìn)行基因比對，以確定兩起情是否有同源性，以利于傷寒病流行病學(xué)監(jiān)測與控制。現(xiàn)將檢測結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株

采用兩起由傷寒沙門氏菌引起的聚集性爆發(fā)流行中所分離到的傷寒沙門氏菌共 11 株。其中；NS-1、2、3、4、5、6、8、9、10、11號為同一起事件分離的菌株；NS-7為另一起事件分離的菌株。

1.2 儀器與試劑

ATB半自動細(xì)菌鑒定儀、VITEK 2-COMPCT、VITEK2G細(xì)菌鑒定卡均由法國生物梅里埃公司生產(chǎn)：脈沖場電泳檢測的儀器及試劑由中國疾控中心實驗室提供并在此完成實驗檢測。細(xì)菌培養(yǎng)所需培養(yǎng)基均由北京陸橋生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)：沙門氏菌診斷血清（30種）由蘭州生物制品研究所提供，均在有效期內(nèi)使用。

1.3 菌株血清型別及生化反應(yīng)

對11株菌株用ATB半自動細(xì)菌鑒定儀進(jìn)行生化鑒定確定其沙門菌屬后，再按GB/T4789.4-2003用沙門菌分型血清進(jìn)行分型。

1.4 DNA指紋圖譜分型（PFGE）方法

1.4.1 凝膠制備 取1 mL細(xì)胞懸濁液（CSB）置于編號的離心管內(nèi)，并設(shè)空白對照，用CSB濕潤接種環(huán)刮取適量細(xì)菌，放入CSB的管中，使其懸濁，比濁度A值為4.2，同時設(shè)立空白對照管。取400 μL菌懸液移入1.5 mL tppendorf離心管中，37℃ 水浴5 min，加入 20 μL蛋白酶K（儲存液濃度為20 mg/mL），充分混勻，加入400 μL 2%低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠，輕輕混勻，倒入凝膠模具，在室溫下10～15 min放置成膠塊。

1.4.2 細(xì)胞裂解 移取5 mL細(xì)胞裂解液于50 mL離心管中，加入 25 μL蛋白酶 K（20 mg/mL），充分混勻，放入凝膠，水浴搖床加熱（54℃，170 r/min，2 h）后倒棄洗液，然后吸取15 mL緩沖液TE（預(yù)熱至50℃），震蕩到凝膠浮于液體中，水浴搖床50℃，10 min，棄去緩沖液TE，重復(fù)此過程3次。最后加入10 mL緩沖液TE，放入4℃環(huán)境中備用。

1.4.3 膠塊內(nèi)DNA的酶切 切1～3 mm膠塊，浸入150 μL酶切體系中（其中含XbaⅠ酶50 U），37℃ 3 h以上或過夜。

1.4.4 加樣 將酶切后的凝膠粘于樣10齒樣品梳齒，加標(biāo)準(zhǔn)菌株H9812于1.5.9孔上，吸干凝膠塊附近液體，室溫下風(fēng)干

3 min，移齒梳入膠槽，倒入100 mL 1%低熔點(diǎn)瓊脂糖（SKG）（55～60℃平衡），室溫下放置30 min。

1.4.5 電泳 取凝固好的膠，放入電泳槽，根據(jù)不同限制性內(nèi)切酶設(shè)置電泳參數(shù)設(shè)置電流參數(shù)，電泳15 h。SfiⅠ酶酶切參數(shù)：50 U，37℃電泳參數(shù)2～10 s，線形條件，電泳時間18 h，電泳溫度14℃。

1.4.6 染色及讀膠 從電泳槽中取出膠塊放入400 mL溴化乙啶（EB）溶液的托盤內(nèi)，置搖床30 min（EB染色），加入500 mL純水，脫色60 min。取出置凝膠成像系統(tǒng)設(shè)備內(nèi)分析。

2 結(jié)果

2.1 生物學(xué)性狀

11株細(xì)菌經(jīng)VITEK細(xì)菌鑒定系統(tǒng)鑒定，生化試驗均符合沙門菌屬，血清型鑒定結(jié)果：11份菌株均與A-F群多價、O-9群、Vi、H-d沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)血清凝集，鹽水不凝。鑒定為傷寒沙門氏菌。

2.2 PFGE指紋圖譜

將兩起分離得傷寒沙門氏菌株11株，經(jīng)XbaⅠ酶切PFGE電泳后，根據(jù)電泳帶的不同，可分為3個型別，每個菌株產(chǎn)生13～15條電泳帶，大小在20～600 kb。其中NS-4、NS-8號菌株條帶相同，NS-7號菌株在668.0～452.7 kb之間及173.4 kb左右個缺少1條條帶，在398.4～452.7 kb之間則出現(xiàn)1條條帶。其余 NS-1、2、3、5、6、9、10、11 號菌株的電泳條帶完全一致。見圖1。

圖1 11株傷寒沙門氏菌PFGE電泳圖譜

3 討論

本研究采用脈沖場電泳分離技術(shù)，用XbaⅠ酶切傷寒沙門氏菌的DNA，經(jīng)電泳后均得到清晰的電泳圖譜。所有菌株的基因組均能被限制性內(nèi)切酶XbaⅠ有效地進(jìn)行酶切，均獲得30.0～668.9 kb的13～15條條帶。從圖譜中可明顯地分出3種PFGE圖譜，即分為3種PFGE型。可以看被檢測菌株的脈沖場電泳圖譜有明顯差異，H9872標(biāo)準(zhǔn)菌株在凝膠不同的位置所產(chǎn)生的電泳圖譜一致性較好，表明凝膠電泳精確性較好，可對圖譜進(jìn)行分析。NS-1、2、3、4、5、6、8、9、10、11 菌株來源于同一疫情樣品，其圖譜一致性較好。NS-7菌株是另一起疫情樣品，其產(chǎn)生的圖譜明顯與前述樣品不一致，說明其差異是由于其本身基因差異引起。提示它們并不是一個克隆系，而是以多克隆系存在，說明兩起傷寒沙門氏菌感染為不同基因型所致。

PFGE分型技術(shù)是傳統(tǒng)的DNA瓊脂糖凝膠電泳的發(fā)展，PFGE具有分辨力高，重復(fù)性好的特點(diǎn)。已在沙門氏菌、霍亂弧菌等細(xì)菌分型中得到廣泛應(yīng)用，被認(rèn)為是細(xì)菌分子流行病學(xué)研究的“金標(biāo)準(zhǔn) ”[2-3]。運(yùn)用脈沖場電泳分離技術(shù)，根據(jù)源性不同的菌株有不同的電泳圖譜，分析細(xì)菌不同血清型的基因組差異，有助于分析追蹤疫情與來源。本研究兩起疫情發(fā)生地相距約60公里，屬不同縣級行政區(qū)劃，兩地人員物資交流較頻繁，多年來兩地由傷寒沙門氏菌引起疾病處于相對較高發(fā)病水平，追蹤其傳染源是制定對于兩地此類疾病疫情監(jiān)測與控制策略的重要前提，此次兩起疫情的不同源性，提示其各自有相對獨(dú)立的傳染源。運(yùn)用脈沖電泳技術(shù)建立與完善恩施州傷寒沙門氏菌電泳圖譜，可以為以后同樣疫情提供重要的參考。

[1] 程均福，王鳴，馮宇良，等.湖北省部分霍亂弧菌毒力基因和基因分型結(jié)果分析 [J].職業(yè)與健康，2009，25（18）：1909-1911.

[2] 金春光，徐景野，章丹陽.傷寒沙門菌的脈沖場凝膠電泳分型方法研究[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2005，l5（10）：1972-1973.

[3] 丁建清，董杰，王書梅，等.脈沖場電泳在霍亂弧菌分型中的應(yīng)用[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2005，15（7）：97，197.

Result analysis of isolating,identificating and genotyping of salmonella typhi in parts of Enshi autonomous prefecture

LIU Jihua YANG Jixian XIE Shurun WU Xiaofeng
Enshi Autonomous Prefecture Center for Disease Control and Prevention,Enshi 445000,China

ObjectiveTo explore and discuss the molecular epidemiology of salmonella typhi in Enshi autonomous prefecture by identification and genotypic of the salmonella typhi which isolated from two cases of aggregative epidemic outbreaks and so to provide a basis for the scientific prevention and cure.MethodsUsing traditional methods to treat 11 bacterial strains of salmonella typhi by biochemical and serological review expert. For confirmed bacterial strains of salmonella typhi, we use pulsed field gel electrophoresis technology to analyse the fingerprints of PFGE.ResultsBy the experiment of PFGE ,11 bacterial strains of salmonella typhi can be divided into 3 types according to the discrepancy of bands.ConclusionTwo cases of salmonella typhi infection are caused by different hypotypes.

Pulsed field gel electrophoresis;Salmonella typhi;Genotyping

R733.3

A

2095-0616（2012）11-92-02

2012-03-09）