范榮軍 李曉鵬 梁 爽 梁 英 懷清杰 任莉娜

哈爾濱市疾病預(yù)防控制中心，黑龍江哈爾濱 150056

微量細(xì)胞培養(yǎng)法在手足口病毒研究中的應(yīng)用

范榮軍 李曉鵬 梁 爽 梁 英 懷清杰 任莉娜

哈爾濱市疾病預(yù)防控制中心，黑龍江哈爾濱 150056

目的 建立應(yīng)用于手足口病毒分離和對手足口EV71病毒抑制藥物篩選的微量細(xì)胞培養(yǎng)方法。 方法 比較微量細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)合real-time PCR和直接應(yīng)用real-time PCR兩種方法檢測手足口病毒的差別，并應(yīng)用微量細(xì)胞培養(yǎng)采用細(xì)胞病變效應(yīng)法和MTT分析法，觀察利巴韋林對EV71病毒的抑制作用。 結(jié)果 經(jīng)微量細(xì)胞培養(yǎng)后EV71、CA16陽性檢出率為90%和80%，但PE陰性樣本20%檢測為EV71陽性；利巴韋林濃度為0.4、0.2、0.1 mg/mL時對EV71病毒有抑制作用，抑制率分別為30.28%、28.09%和29.16%。 結(jié)論 微量細(xì)胞培養(yǎng)在手足口病毒分離檢測和對其抑制作用藥物篩選研究中具有可行性，且其具有操作簡便、省時省力等優(yōu)點。

微量細(xì)胞培養(yǎng)；手足口；病毒分離；藥物篩選

手足口病是由多種腸道病毒引起的腸道傳染病，最常見的為EV71型和COXA16 型，多發(fā)于5歲以下兒童，每年3～7月為發(fā)病高峰[1]?；純汉碗[性感染者均為傳染源，主要通過消化道、呼吸道和密切接觸等途徑傳播，主要癥狀表現(xiàn)為手、足、口腔等部位的斑丘疹、皰疹。重癥病例可出現(xiàn)腦膜炎、腦炎、腦脊髓炎、肺水腫、循環(huán)障礙等，多由EV71感染引起[2]。本研究對微量細(xì)胞培養(yǎng)法檢測手足口病毒及對手足口EV71病毒的抑制藥物篩選方法的建立介紹如下。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

核酸提取儀（德國QIAGEN公司，QIAcube型），熒光定量PCR儀（美國ABI公司，7500 型），CO2培養(yǎng)箱（日本SANYO公司，MCO-15A型），倒置顯微鏡（日本Nikon公司，TE2000-5型），酶標(biāo)儀（美國BIO-RAD公司，MODEL680型）。

1.2 試劑

核酸提取試劑盒（德國Qiagen公司，批號：139287329），MEM（美國Gibco公司，批號：1280330），胎牛血清（美國Hyclone公司，批號：NWCO389），EDTA-胰酶（美國 Gibco公司，批號：833117），利巴韋林注射液（山東華魯制藥有限公司，批號：D11112409），PBS（美國 Gibco公司，批號：615079），二甲基亞砜（美國Sigma公司，批號：D5879），MTT（美國Amresco公司，批號：0793），手足口real-time PCR檢測試劑盒（江蘇碩世生物科技有限公司 20110902）。

2 方法

2.1 微量細(xì)胞培養(yǎng)法在手足口病毒檢測中的應(yīng)用

2.1.1 標(biāo)本的選擇 選擇本實驗室2011年采集置- 70℃保存的咽拭子，經(jīng)real-time PCR方法檢測，EV71陽性樣本10份，CA16陽性樣本10份，PE陰性樣本10份。

2.1.2 微量細(xì)胞準(zhǔn)備 用人喉癌上皮細(xì)胞（Hep Ⅱ細(xì)胞）經(jīng)EDTA-胰酶消化后按（2～5）×106個/mL細(xì)胞密度傳代接種于無菌的96孔微量細(xì)胞板，每孔100 μL， 置36℃含5%CO2培養(yǎng)箱中，2 d后細(xì)胞即可長成單層即可用。

2.1.3 病毒分離[3-4]將準(zhǔn)備好的細(xì)胞棄去培養(yǎng)液，用不含小牛血清的病毒培養(yǎng)液洗2 次， 每份標(biāo)本接4孔，50 μL/孔，預(yù)留4孔作細(xì)胞對照。置34℃含5%CO2培養(yǎng)箱吸附2 h，吸棄標(biāo)本液，再用不含小牛血清的病毒培養(yǎng)液洗1次， 每孔加200 μL病毒培養(yǎng)液，置34℃含5% CO2培養(yǎng)箱，連續(xù)每天倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞病變，采用細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）法。

2.1.4 結(jié)果檢測 小心吸取合并病變的相同樣本孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，用real-time PCR法檢測上清培養(yǎng)液。

2.2 微量細(xì)胞培養(yǎng)法篩選對EV71病毒抑制藥物方法的建立

2.2.1 病毒增殖[3]將EV71病毒接種于單層Hep Ⅱ細(xì)胞上，加病毒培養(yǎng)液置34℃含5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d后出現(xiàn)90%以上的病變，凍融3次后吹打離心，定量分裝，置-80℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 病毒感染性的測定[5]將EV71病毒液10倍遞次稀釋成1×10-1～1×10-88個濃度，用病毒液接種培養(yǎng)板，每個稀釋度設(shè)10孔，同時設(shè)不加病毒液的正常細(xì)胞對照培養(yǎng)。每日在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞病變，CPE記錄方法為：無CPE為“-”，25%以下細(xì)胞病變?yōu)椤?”，25%～50%細(xì)胞病變?yōu)椤?+”，＞50%～75%細(xì)胞病變?yōu)椤?++”，＞75%～100%的細(xì)胞病變?yōu)椤?+++”。用Reed-Muench公式計算病毒液的TCID50。

2.2.3 利巴韋林細(xì)胞毒性檢測 將利巴韋林注射液用細(xì)胞培養(yǎng)液 1∶ 1、1∶ 2、1∶ 4、1∶ 8、1∶ 16稀釋，接種于準(zhǔn)備好的細(xì)胞上，每個稀釋度設(shè)4孔，同時設(shè)不加藥液的正常細(xì)胞對照培養(yǎng)，每日觀察細(xì)胞病變，連續(xù)7 d觀察藥物毒性，細(xì)胞出現(xiàn)病變者判為藥物毒性，并根據(jù)Reed-Muench公式計算利巴韋林注射液對Hep Ⅱ細(xì)胞的毒性。

2.2.4 利巴韋林對EV71病毒的作用 取準(zhǔn)備好的細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，用不含小牛血清的病毒培養(yǎng)液洗2次，每孔接種100TCID50的病毒液，預(yù)留4孔作細(xì)胞對照，置34℃含5% CO2培養(yǎng)箱吸附2 h，吸棄病毒液，再用不含小牛血清的病毒培養(yǎng)液洗1次，每孔加100 μL起始濃度為0.4 mg/mL的利巴韋林藥液，并對倍稀釋，連續(xù)10個稀釋度，每個稀釋度設(shè)4孔，設(shè)病毒對照4孔，置34℃含5%CO2培養(yǎng)箱，連續(xù)每天倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞病變。當(dāng)病毒對照出現(xiàn)75%以上細(xì)胞病變時，吸棄孔內(nèi)液體，每孔加MTT溶液（5 mg/mL用PBS配制，pH=7.4）20 μL，繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，小心吸棄并合并相同樣本孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，對于懸浮細(xì)胞需要離心后再吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加100 μL二甲基亞砜，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分融解。酶標(biāo)儀上490 nm處測定OD值[6]。并根據(jù)公式計算利巴韋林注射液對EV71病毒的抑制率。病毒抑制率=（試驗組平均OD值-病毒對照組平均OD值）/（細(xì)胞對照組平均OD值-病毒對照組平均OD值）×100%。

3 結(jié)果

3.1 微量細(xì)胞培養(yǎng)-real-time PCR法與real-time PCR法結(jié)果比較（表1）

由表1可見，real-time PCR法直接檢測的1份EV71樣本和2份CA16樣本未引起Hep Ⅱ細(xì)胞發(fā)生病變，而2份陰性樣本經(jīng)Hep Ⅱ細(xì)胞培養(yǎng)增殖后經(jīng)real-time PCR法檢測為EV71陽性。

表1 微量細(xì)胞培養(yǎng)-real-time PCR法與real-time PCR法結(jié)果

3.2 利巴韋林對EV71病毒的抑制作用

3.2.1 EV71病毒感染性的測定 根據(jù)在倒置顯微鏡下連續(xù)觀察細(xì)胞病變，Reed-Muench法計算TCID50。TCID50=Antilog[CPE＞50%病毒稀釋度+（＞50%的百分?jǐn)?shù)-50）/（＞50%的百分?jǐn)?shù)-＜50%的百分?jǐn)?shù)）×lg10]計算結(jié)果本次實驗的所得到的EV71病毒液的TCID50為：2.43×10-6/0.1 mL。

3.2.2 利巴韋林細(xì)胞毒性檢測結(jié)果 利巴韋林對Hep Ⅱ細(xì)胞的的半數(shù)毒性濃度（TC50）為1.49 mg/mL。濃度為0.4 mg/mL的利巴韋林處理Hep Ⅱ細(xì)胞時，CPE觀察無細(xì)胞病變，MTT法分析細(xì)胞存活率為83.8%。因此以0.4 mg/mL作為利巴韋林抗EV71病毒活性檢測的起始濃度。

3.2.3 利巴韋林抗EV71病毒活性 CPE觀察法和MTT分析法檢測利巴韋林抗EV71病毒的抑制效率，利巴韋林濃度為0.4、0.2、0.1 mg/mL時對EV71病毒的抑制率分別為30.28%、28.09%和29.16%，當(dāng)利巴韋林濃度為0.05 mg/mL及以下時則對EV71病毒無明顯抑制作用。見表2。

4 討論

經(jīng)微量細(xì)胞培養(yǎng)后EV71、CA16陽性檢出率分別為90%和80%，可能是由于細(xì)胞對病毒的敏感度不同，使得有些病毒未增殖成功，如果使用兩種細(xì)胞系可能會得到較好的結(jié)果；而PE陰性樣本20%檢測為EV71陽性，是由于經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)是一個病毒擴(kuò)增、增毒的過程，從而增加了real-time PCR的檢出率[7]。病毒分離培養(yǎng)對流行病學(xué)分析具有重要意義，但由于病毒培養(yǎng)耗時，往往貽誤特異性治療，使得其對臨床診斷具有一定的限制性[8]。因此，在具體檢驗工作中，我們應(yīng)根據(jù)工作需要選擇合適的檢驗方法。

在實驗選取的利巴韋林濃度為0.4～0.1 mg/mL時對EV71有抑制作用，3個濃度的抑制效果差異不顯著。在以往的抗病毒研究中，用光鏡觀察CPE是常用的方法，但這種方法比較繁瑣，劃分等級粗糙，而且需要一定的經(jīng)驗。而MTT法作為一種抗病毒活性的評價方法具有快速、簡便、敏感、高效等特點，能在較短的時間內(nèi)對大量的藥物進(jìn)行篩選和評價，省去了繁瑣的實驗程序，而且取得的數(shù)據(jù)客觀可靠，是較為理想的實驗方法[9]。

表2 利巴韋林抗EV71病毒活性結(jié)果

微量細(xì)胞培養(yǎng)在手足口病毒分離檢測和對其抑制作用藥物篩選研究中具有可行性，且其具有操作簡便、省時省力等優(yōu)點。在應(yīng)用此法的過程中，筆者認(rèn)為控制標(biāo)本間的交叉污染是整個實驗成敗的關(guān)鍵。

[1] 郭照江，王憲斌，溫紅偉.利巴韋林氣霧劑對手足口病應(yīng)急預(yù)防應(yīng)用研究[J].中國醫(yī)藥科學(xué)，2012，2（3）：113-114.

[2] 尹勝平，蔣茵，覃平，等.重癥手足口病52例治療總結(jié)[J].中國醫(yī)藥科學(xué)，2012，2（3）：15-18.

[3] 衛(wèi)生部.手足口病預(yù)防控制指南[M].北京：衛(wèi)生部，2009：1.

[4] 狄飚，伍頌民，周秀珍，等.微量細(xì)胞培養(yǎng)法在分離流感病毒中的應(yīng)用[J].疾病監(jiān)測，2001，16（1）：5-6.

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[6] 徐春華.MTT法檢測大豆異黃酮對癌細(xì)胞的生長抑制作用[J].中央民族大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2012，21（1）：58-62.

[7] 梁英，懷清杰，張炳麗，等.兩種檢測方法對EV71病毒監(jiān)測結(jié)果的影響研究 [J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2010，20（7）：1590-1592.

[8] 田燕，陸志剛，梁潔.手足口病檢測方法的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2011，38（15）：3058-3060.

[9] 劉釗，楊占秋，肖紅，等.MTT法在抗病毒藥物篩選中的應(yīng)用[J].武漢大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2004，25（3）：332-335.

The application of trace cell culture method in the EV71 virus research

FAN Rongjun LI Xiaopeng LIANG Shuang LIANG Ying HUAI Qingjie REN Lina
Harbin Center for Disease Control and Prevention,Harbin 150056,China

ObjectiveTo construct a trace cell culture method for isolating the hand-foot-and-mouth virus and screening drugs to inhibit the EV71 virus.MethodsThe differences of EV71 virus detection using a combination of trace cell culture and real-time PCR or single real-time PCR were studied, and inhibition effects of ribavirin against EV71 were investigated through the trace cell culture using cytopathic effect and MTT analysis.ResultsThrough the trace cell culture, EV71 and CA-16 positive detection ratio values were 90% and 80%, respectively; and the EV71-positive value was 20% in PE negative samples. With the ribavirin concentration of 0.4,0.2,0.1 mg/mL,the inhibition ratio values against EV71 virus were 30.28%,28.09% and 29.61%, respectively.ConclusionThe trace cell culture method is feasible for the isolating and detecting the hand-foot-and-mouth virus, and also the screening of inhibition drugs. Meanwhile, this method is more simple, convenient and time-saving.

Trace cell culture;Hand-foot-and-mouth disease;Virus isolation;Drug screening

R183.4

A

2095-0616（2012）11-14-03

黑龍江省哈爾濱市科技創(chuàng)新人才研究專項資金項目（2009RFQQS007）。

2012-05-02）