馬學(xué)琴,康小蘭,王 飛,付雪艷,何志梅
(寧夏醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院,寧夏 銀川 750004)
鐵棒錘是毛茛科烏頭屬植物鐵棒錘Aconitum szechenyianumGay.和伏毛鐵棒錘Aconitum Flavum Hand.Mazz.的干燥塊根[1]。2010年版中國(guó)藥典未收載品種,為陜、甘、寧等省應(yīng)用較廣的一種民間草藥[2]。其味苦辛,性熱,有大毒,具“活血祛瘀,祛風(fēng)濕,止痛”等作用[3]。目前,課題組對(duì)其所含的總生物堿以及烏頭堿的含量已有研究[4-5]。本研究繼續(xù)從綜合評(píng)價(jià)伏毛鐵棒錘質(zhì)量的角度出發(fā),建立其HPLC指紋圖譜,為伏毛鐵棒錘藥材的鑒定提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
日立LC-2000高效液相色譜儀;島津UV-2550紫外分光光度計(jì);奧豪斯AP210型分析天平。
烏頭堿對(duì)照品(批號(hào)110720-200409);甲醇、乙腈(色譜純,美國(guó)TEDIA);娃哈哈純凈水;其它試劑均為分析純。鐵棒錘為自采,來(lái)源:固原六盤(pán)山(樣品編號(hào)S1-S3)、月亮山(樣品編號(hào)S4-S5)、種植園(樣品編號(hào)S6-S8)、黑城鄉(xiāng)(樣品編號(hào)S9-S10);經(jīng)寧夏醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室鑒定為毛茛科烏頭屬植物伏毛鐵棒錘AconitumFlavum Hand.Mazz.的干燥塊根。
色譜柱:美國(guó) Thermo ODS-2HYPERSIL(250mm×4.6mm,5μm);流動(dòng)相:A-甲醇-乙腈(3∶2),B-醋酸-醋酸鈉(pH=4.5)緩沖液梯度洗脫:0~10min 1%~5%A,10~30min 5%~15%A,30~40min 15%~25%A,40~50min 25%~80%A,50~60min 80%~100%A,60~70min 100%A;檢測(cè)波長(zhǎng):240~280nm,流速0.8mL/min,柱溫:30℃。
精密稱量烏頭堿對(duì)照品5.6mg,置5mL容量瓶中,色譜甲醇溶解,定容,得烏頭堿對(duì)照品貯備液。
取伏毛鐵棒錘藥材,粉碎,過(guò)80目篩,60℃干燥至恒重。精密稱取適量(相當(dāng)生藥1g),置200mL具塞三角錐形瓶中,加入氯仿-甲醇-水(6∶4∶1)20mL,超聲提取40min,冷卻,過(guò)濾,濾液水浴蒸干,殘?jiān)眉状既芙獠⒍ㄈ葜?0mL得供試品溶液,臨用前0.45μm微孔濾膜過(guò)濾。
(1)精密度試驗(yàn):按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,取同一供試液,連續(xù)進(jìn)樣6次,按“2.1”色譜條件測(cè)定,選擇25個(gè)共有峰進(jìn)行比較。結(jié)果表明,各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD<0.23%,各共有峰的相對(duì)峰面積RSD<2.14,表明供試品的精密度良好。
(2)重復(fù)性試驗(yàn):取同一批次伏毛鐵棒錘藥材,按“2.3”項(xiàng)下方法平行操作,制備6份供試液,按“2.1”色譜條件測(cè)定。結(jié)果表明,各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD<1.15%,各共有峰的相對(duì)峰面積RSD<2.78,表明方法的重現(xiàn)性良好。
(3)穩(wěn)定性試驗(yàn):取同一供試品溶液,分別于0、2、4、8、12、24h進(jìn)樣測(cè)定,對(duì)25個(gè)共有峰進(jìn)行比較,結(jié)果各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD<0.21%,各共有峰的相對(duì)峰面積RSD<1.66%,表明供試品溶液在24內(nèi)穩(wěn)定。
按照“2.3”項(xiàng)下方法,制備10批次伏毛鐵棒錘供試液,按“2.1”色譜條件測(cè)定并記錄色譜圖。采用國(guó)家藥典委員會(huì)頒布的《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)A版》軟件自動(dòng)匹配10批次伏毛鐵棒錘藥材HPLC色譜圖相關(guān)參數(shù),以平均數(shù)法作為對(duì)照指紋圖譜的生成方法,設(shè)時(shí)間窗寬度為0.2min,提取伏毛鐵棒錘藥材的共有模式建立對(duì)照指紋圖譜,見(jiàn)圖1。
圖1 伏毛鐵棒錘藥材對(duì)照指紋圖譜
標(biāo)定共有峰共25個(gè),以峰面積較大的5號(hào)峰為參照物峰,分別計(jì)算其余共有峰與5號(hào)參照物峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果表明,10批次伏毛鐵棒錘藥材共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD小于0.5%,而相對(duì)峰面積RSD在11.34~27.61之間,說(shuō)明各批次藥材之間共有峰的保留時(shí)間有著很好的一致性,但由于來(lái)源的不同,其峰面積相差較大。
將10批伏毛鐵棒錘藥材樣品指紋圖譜導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)A版》軟件,計(jì)算各樣品指紋圖譜與生成的對(duì)照?qǐng)D譜的相似度,樣品S1~S10的相似度依次為0.927、0.901、0.953、0.918、0.911、0.926、0.916、0.933、0.937、0.903。結(jié)果表明,10批次藥材與對(duì)照指紋圖譜的相似度結(jié)果均大于0.9,相關(guān)性良好。
本實(shí)驗(yàn)所采集藥材均來(lái)自寧夏中部干旱帶固原地區(qū),海拔高度在2600m左右,是伏毛鐵棒錘聚集生長(zhǎng)的地區(qū)。由于此地區(qū)土壤、水分、氣候、陽(yáng)光、溫度等條件較為相似,并且所采集的伏毛鐵棒錘均為兩年生,故藥材之間一致性較好,相似度均在0.9以上。
本實(shí)驗(yàn)最初以烏頭堿色譜峰作為參照物峰,但其峰面積相對(duì)較?。ǚ迕娣e<總峰面積的5%),根據(jù)《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求》中的規(guī)定,峰面積相對(duì)較小的色譜峰誤差較大,不適宜作為參照物峰。故本實(shí)驗(yàn)選擇峰面積相對(duì)較大的5號(hào)色譜峰作為參照物峰,其余共有峰與其的比值誤差較小,結(jié)果較為準(zhǔn)確。
本實(shí)驗(yàn)采用DAD檢測(cè)器,在進(jìn)行供試品溶液全波長(zhǎng)掃描時(shí),供試液的最大吸光度在260nm,故選用240~280nm整合波長(zhǎng)的色譜圖,能夠捕捉到更多的色譜峰。
本實(shí)驗(yàn)選用70%乙醇、100%甲醇、氯仿-甲醇(2∶1)、氯仿-甲醇-水(6∶4∶1)等溶劑,回流、超聲等提取方法,并進(jìn)行了提取工藝的正交試驗(yàn),以峰之間的分離度和峰的個(gè)數(shù)為指標(biāo),優(yōu)選出氯仿-甲醇-水(6∶4∶1)為溶劑,超聲提取時(shí),供試液色譜峰的個(gè)數(shù)最多且分離度較好,故選用此法。
本研究建立了伏毛鐵棒錘HPLC指紋圖譜,從藥材整體色譜圖入手,選取了25個(gè)特征峰構(gòu)成了伏毛鐵棒錘的指紋圖譜,能提供更全面的質(zhì)量控制信息,為鑒別該藥材提供了更多的參考數(shù)據(jù)。
[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典[S].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,1985.
[2]張銀霞,張銀娟,唐建寧,等.六盤(pán)山區(qū)伏毛鐵棒錘資源調(diào)查的研究與評(píng)價(jià)[J].農(nóng)業(yè)科學(xué)研究,2008,29(1):55-57.
[3]王毓杰,張 靜,田會(huì)萍,等.民族藥鐵棒錘炮制減毒原理初步研究[J].中國(guó)中藥雜志,2010,35(5):588-592.
[4]付雪艷,董 琳,權(quán)洪峰,等.鐵棒錘總生物堿的含量測(cè)定[J].科協(xié)論壇,2007(8):476.
[5]付雪艷,董 琳,張義偉,等.HPLC測(cè)定鐵棒錘中烏頭堿的含量[J].科協(xié)論壇,2007(8):456.