馬學(xué)琴，康小蘭，王 飛，付雪艷，何志梅

（寧夏醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，寧夏 銀川 750004）

鐵棒錘是毛茛科烏頭屬植物鐵棒錘Aconitum szechenyianumGay.和伏毛鐵棒錘Aconitum Flavum Hand.Mazz.的干燥塊根[1]。2010年版中國(guó)藥典未收載品種，為陜、甘、寧等省應(yīng)用較廣的一種民間草藥[2]。其味苦辛，性熱，有大毒，具“活血祛瘀，祛風(fēng)濕，止痛”等作用[3]。目前，課題組對(duì)其所含的總生物堿以及烏頭堿的含量已有研究[4－5]。本研究繼續(xù)從綜合評(píng)價(jià)伏毛鐵棒錘質(zhì)量的角度出發(fā)，建立其HPLC指紋圖譜，為伏毛鐵棒錘藥材的鑒定提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

日立LC-2000高效液相色譜儀；島津UV-2550紫外分光光度計(jì)；奧豪斯AP210型分析天平。

1.2 藥品與試劑

烏頭堿對(duì)照品（批號(hào)110720-200409）；甲醇、乙腈（色譜純，美國(guó)TEDIA）；娃哈哈純凈水；其它試劑均為分析純。鐵棒錘為自采，來(lái)源：固原六盤(pán)山（樣品編號(hào)S1－S3）、月亮山（樣品編號(hào)S4－S5）、種植園（樣品編號(hào)S6－S8）、黑城鄉(xiāng)（樣品編號(hào)S9－S10）；經(jīng)寧夏醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室鑒定為毛茛科烏頭屬植物伏毛鐵棒錘AconitumFlavum Hand.Mazz.的干燥塊根。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱：美國(guó) Thermo ODS-2HYPERSIL（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：A-甲醇－乙腈（3∶2），B-醋酸－醋酸鈉（pH＝4.5）緩沖液梯度洗脫：0～10min 1%～5%A，10～30min 5%～15%A，30～40min 15%～25%A，40～50min 25%～80%A，50～60min 80%～100%A，60～70min 100%A；檢測(cè)波長(zhǎng)：240～280nm，流速0.8mL／min，柱溫：30℃。

2.2 對(duì)照品溶液制備

精密稱量烏頭堿對(duì)照品5.6mg，置5mL容量瓶中，色譜甲醇溶解，定容，得烏頭堿對(duì)照品貯備液。

2.3 供試品溶液制備

取伏毛鐵棒錘藥材，粉碎，過(guò)80目篩，60℃干燥至恒重。精密稱取適量（相當(dāng)生藥1g），置200mL具塞三角錐形瓶中，加入氯仿－甲醇－水（6∶4∶1）20mL，超聲提取40min，冷卻，過(guò)濾，濾液水浴蒸干，殘?jiān)眉状既芙獠⒍ㄈ葜?0mL得供試品溶液，臨用前0.45μm微孔濾膜過(guò)濾。

2.4 伏毛鐵棒錘藥材指紋圖譜方法學(xué)考察

（1）精密度試驗(yàn)：按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，取同一供試液，連續(xù)進(jìn)樣6次，按“2.1”色譜條件測(cè)定，選擇25個(gè)共有峰進(jìn)行比較。結(jié)果表明，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD＜0.23%，各共有峰的相對(duì)峰面積RSD＜2.14，表明供試品的精密度良好。

（2）重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批次伏毛鐵棒錘藥材，按“2.3”項(xiàng)下方法平行操作，制備6份供試液，按“2.1”色譜條件測(cè)定。結(jié)果表明，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD＜1.15%，各共有峰的相對(duì)峰面積RSD＜2.78，表明方法的重現(xiàn)性良好。

（3）穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24h進(jìn)樣測(cè)定，對(duì)25個(gè)共有峰進(jìn)行比較，結(jié)果各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD＜0.21%，各共有峰的相對(duì)峰面積RSD＜1.66%，表明供試品溶液在24內(nèi)穩(wěn)定。

3 結(jié)果

3.1 指紋圖譜的采集及共有峰的標(biāo)定

按照“2.3”項(xiàng)下方法，制備10批次伏毛鐵棒錘供試液，按“2.1”色譜條件測(cè)定并記錄色譜圖。采用國(guó)家藥典委員會(huì)頒布的《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)A版》軟件自動(dòng)匹配10批次伏毛鐵棒錘藥材HPLC色譜圖相關(guān)參數(shù)，以平均數(shù)法作為對(duì)照指紋圖譜的生成方法，設(shè)時(shí)間窗寬度為0.2min，提取伏毛鐵棒錘藥材的共有模式建立對(duì)照指紋圖譜，見(jiàn)圖1。

圖1 伏毛鐵棒錘藥材對(duì)照指紋圖譜

標(biāo)定共有峰共25個(gè)，以峰面積較大的5號(hào)峰為參照物峰，分別計(jì)算其余共有峰與5號(hào)參照物峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果表明，10批次伏毛鐵棒錘藥材共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD小于0.5%，而相對(duì)峰面積RSD在11.34～27.61之間，說(shuō)明各批次藥材之間共有峰的保留時(shí)間有著很好的一致性，但由于來(lái)源的不同，其峰面積相差較大。

3.2 相似度計(jì)算

將10批伏毛鐵棒錘藥材樣品指紋圖譜導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)A版》軟件，計(jì)算各樣品指紋圖譜與生成的對(duì)照?qǐng)D譜的相似度，樣品S1～S10的相似度依次為0.927、0.901、0.953、0.918、0.911、0.926、0.916、0.933、0.937、0.903。結(jié)果表明，10批次藥材與對(duì)照指紋圖譜的相似度結(jié)果均大于0.9，相關(guān)性良好。

4 討論

4.1 伏毛鐵棒錘藥材相似度評(píng)價(jià)

本實(shí)驗(yàn)所采集藥材均來(lái)自寧夏中部干旱帶固原地區(qū)，海拔高度在2600m左右，是伏毛鐵棒錘聚集生長(zhǎng)的地區(qū)。由于此地區(qū)土壤、水分、氣候、陽(yáng)光、溫度等條件較為相似，并且所采集的伏毛鐵棒錘均為兩年生，故藥材之間一致性較好，相似度均在0.9以上。

4.2 指紋圖譜參照物峰的選擇

本實(shí)驗(yàn)最初以烏頭堿色譜峰作為參照物峰，但其峰面積相對(duì)較?。ǚ迕娣e＜總峰面積的5%），根據(jù)《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求》中的規(guī)定，峰面積相對(duì)較小的色譜峰誤差較大，不適宜作為參照物峰。故本實(shí)驗(yàn)選擇峰面積相對(duì)較大的5號(hào)色譜峰作為參照物峰，其余共有峰與其的比值誤差較小，結(jié)果較為準(zhǔn)確。

4.3 波長(zhǎng)的選擇

本實(shí)驗(yàn)采用DAD檢測(cè)器，在進(jìn)行供試品溶液全波長(zhǎng)掃描時(shí)，供試液的最大吸光度在260nm，故選用240～280nm整合波長(zhǎng)的色譜圖，能夠捕捉到更多的色譜峰。

4.4 供試品制備方法的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)選用70%乙醇、100%甲醇、氯仿－甲醇（2∶1）、氯仿－甲醇－水（6∶4∶1）等溶劑，回流、超聲等提取方法，并進(jìn)行了提取工藝的正交試驗(yàn)，以峰之間的分離度和峰的個(gè)數(shù)為指標(biāo)，優(yōu)選出氯仿－甲醇－水（6∶4∶1）為溶劑，超聲提取時(shí)，供試液色譜峰的個(gè)數(shù)最多且分離度較好，故選用此法。

本研究建立了伏毛鐵棒錘HPLC指紋圖譜，從藥材整體色譜圖入手，選取了25個(gè)特征峰構(gòu)成了伏毛鐵棒錘的指紋圖譜，能提供更全面的質(zhì)量控制信息，為鑒別該藥材提供了更多的參考數(shù)據(jù)。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典[S].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，1985.

[2]張銀霞，張銀娟，唐建寧，等.六盤(pán)山區(qū)伏毛鐵棒錘資源調(diào)查的研究與評(píng)價(jià)[J].農(nóng)業(yè)科學(xué)研究，2008，29（1）：55-57.

[3]王毓杰，張 靜，田會(huì)萍，等.民族藥鐵棒錘炮制減毒原理初步研究[J].中國(guó)中藥雜志，2010，35（5）：588-592.

[4]付雪艷，董 琳，權(quán)洪峰，等.鐵棒錘總生物堿的含量測(cè)定[J].科協(xié)論壇，2007（8）：476.

[5]付雪艷，董 琳，張義偉，等.HPLC測(cè)定鐵棒錘中烏頭堿的含量[J].科協(xié)論壇，2007（8）：456.