趙凱華，劉 珂，趙 烽

（煙臺大學(xué) 藥學(xué)院，山東 煙臺 264005）

豨薟草為菊科豨薟屬一年生草本植物，主要功效為：祛風(fēng)濕，利筋骨，治風(fēng)濕頑痹；消炎止痛。2005年版藥典中記載：豨薟丸可清熱祛濕，散風(fēng)止痛［1］。筆者前期以抑制LPS誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞釋放NO及TNF-α為活性指標(biāo)，明確了石油醚層為其抗風(fēng)濕的主要活性部位［2］。為進(jìn)一步闡明其抗風(fēng)濕的作用物質(zhì)基礎(chǔ)，進(jìn)一步從石油醚層提取分離得到4個單體化合物，通過理化常數(shù)測定、化學(xué)反應(yīng)及波譜分析等手段鑒定了結(jié)構(gòu)?；钚詼y試結(jié)果表明，化合物1～3對LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞釋放NO具有明顯的抑制活性，IC50分別為13.1μg／mL，13.9μg／mL，5.9μg／mL，優(yōu)于陽性藥物氫化可的松。化合物3還對巨噬細(xì)胞釋放TNF-α具有明顯的抑制作用，IC50為1.6μg／mL。

1 材料與方法

1.1 藥材與試劑

腺梗豨薟購自藥材市場，由沈陽藥科大學(xué)生藥教研室孫啟時教授鑒定為腺梗豨薟Siegesbeckia pubescens Makino；小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW 264.7為煙臺大學(xué)藥學(xué)院自行保種（ATCC TIB-71）；RPMI 1640、胎牛血清購自 Hyclone公司；青霉素-鏈霉素雙抗溶液、胰酶消化液、小鼠TNF-α ELISA試劑盒為煙臺賽爾斯生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

RAW 264.7細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)，隔天傳代。

1.3 對LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞釋放NO的抑制活性測定

按照文獻(xiàn)［2］描述的方法進(jìn)行。

1.4 ELISA法測定TNF-α

按照文獻(xiàn)［3］描述的方法進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 提取分離

腺梗豨薟10kg粉碎，甲醇滲漉2天，重復(fù)3次，減壓回收甲醇得浸膏595.8g。分散至水中，分別用等體積石油醚、乙酸乙酯、正丁醇進(jìn)行萃取，濃縮干燥得石油醚浸膏123.3g，乙酸乙酯浸膏114.9g，正丁醇浸膏100.8g，水層165.3g。石油醚部位用硅膠色譜柱，以正己烷-乙酸乙酯不同梯度混合溶劑反復(fù)柱層析，薄層層析監(jiān)控，相同組分合并，共得到16個子餾分。將活性較好的6個餾分（9～11，13～15）繼續(xù)反復(fù)柱層析，薄層層析監(jiān)控，并結(jié)合制備薄層和柱層析得到化合物1～4。

2.3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：白色粘狀固體，m.p.70℃～70.5℃，易溶于氯仿，乙醚，難溶于水。13C-NMR譜中δ180.1處碳信號表明該化合物存在羧基，1H-NMR譜中芳香區(qū)無任何信號，因此化合物可能為飽和脂肪酸類，結(jié)合1H-NMR、13C-NMR譜確定分子式為C24H48O2。其理化性質(zhì)及波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［4］報道的二十四碳酸（tetracosa-carbonic acid）一致。

化合物2：白色片狀結(jié)晶，m.p.137℃～139℃。與β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)品混合物熔點不下降，在硅膠薄層色譜上10%硫酸顯紫紅色，并且與β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)品共薄層Rf值一致。其理化性質(zhì)及波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［4］報道的β-谷甾醇（β-sitosterol）一致。

化合物3：白色針狀晶體，m.p.298℃～303℃。DEPT譜中顯示該化合物中有7個伯碳，9個仲碳，7個叔碳，7個季碳。結(jié)合碳譜可推斷其分子式可能為C30H48O3。1HNMR（400MHz，C5D5N）譜中，在δ0.62～1.50的高場間，共出現(xiàn)了5個甲基單峰信號0.89，1.02，1.06，1.23，1.25，說明該化合物有可能是三萜類，所對應(yīng)的碳信號分別為：15.6，17.5，16.5，23.9，28.8。同時還有2個甲基雙峰信號0.96和1.00，分別對應(yīng)的碳信號為21.4和17.4，提示該三萜化合物為烏蘇烷型三萜。氫譜在δ5.49處有一三峰，可能是一雙鍵氫信號，從HSQC中可以知道其所對應(yīng)的碳信號為125.6，同時低場區(qū)139.2處還有一季碳信號，可以推斷該化合物中存在-CH2-CH＝C-結(jié)構(gòu)。179.9處碳信號表明該化合物中可能存在羧基基團(tuán)。氫譜中3.47（1H，t）所對應(yīng)的碳信號為78.1，說明該碳可能與氧相連，其結(jié)構(gòu)片段可能為-CH2-CH-OH。綜上所述，推斷該化合物中含有單羥基取代的12-烯-28-酸結(jié)構(gòu)單元。譜圖數(shù)據(jù)見表1，綜合其理化性質(zhì)及波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［6］報道的熊果酸（ursolic acid）一致。

化合物4：羽毛狀結(jié)晶，m.p.186℃～187℃。1H-NMR（400MHz，CDCl3）譜中，芳香區(qū)有15個氫信號，可能存在三個單取代苯環(huán)，分別為：7.71（2H，d，J＝8.0Hz），7.52（1H，tt，J＝8.0Hz），7.44（2H，t，J＝8.0Hz），7.29（2H，m），7.24（3H，m），7.15（3H，m），7.07 （2H，m），由 HSQC 譜可知道，所對應(yīng)的碳信號分別為：127.0，131.9，128.6，128.7，129.3和127.1，128.5和126.7，129.1。低場區(qū)136.7，136.6，133.7為三個苯環(huán)上的季碳信號。氫譜中6.78（1H，d，J＝7.6Hz），6.02 （1H，d，J＝8.6Hz）兩 個 氫信號沒有與之相對應(yīng)的碳信號，說明該化合物中存在兩個NH結(jié)構(gòu)。3.92（1H，dd），3.81（1H，dd）對應(yīng)64.7一個碳信號，說明該仲碳可能與手性碳相連。3.23（1H，dd），3.06（1H，dd）與38.4相對應(yīng)，同樣是一個與手性碳相連的仲碳。2.03處為一個與羰基相連的甲基信號。13C-NMR（100MHz，CDCl3）譜中，170.7，170.2，167.1為三個酯羰基或酰羰基信號。結(jié)合HMBC譜，確定該化合物結(jié)構(gòu)，波譜數(shù)據(jù)見表2，與已知文獻(xiàn)［7］報道的N-（N-苯甲?；?L-苯丙胺?；?O-乙酰基-L-苯丙氨醇（N-（N-ben-zoyl-L-phenylalanyl）-O-actyl-L-phenylalanol）基本一致。但如下圖所示：從其HMBC譜中可以看到 H-7’（δ：7.13）與C-6’（δ：128.7）遠(yuǎn)程相關(guān)，H-5’（δ：7.07）與C-7’（δ：126.7）遠(yuǎn)程相關(guān)，所以文獻(xiàn)中C-7’的化學(xué)位移應(yīng)由128.5改為126.7。同樣：H-4”（δ：7.44）與C-3”（δ：127.0），C-2”（δ：133.7）遠(yuǎn)程相關(guān)，文獻(xiàn)中C-4”的化學(xué)位移應(yīng)由126.7改為128.6。

表1 化合物3中的1 H-NMR and 13C-NMR譜圖數(shù)據(jù)（C5D5N）

表2 化合物4中1 H-NMR and 13C-NMR譜圖數(shù)據(jù)（CDCl3）

圖1

2.3 化合物1～4對巨噬細(xì)胞釋放NO和TNF-α的抑制

表3 化合物1～4對巨噬細(xì)胞釋放NO和TNF-α的抑制活性結(jié)果

3 討論

筆者從腺梗豨薟抗風(fēng)濕的主要活性部位分離鑒定了4個單體化合物，1-3對LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞釋放NO具有明顯的抑制活性，IC50分別為13.1μg／mL，13.9μg／mL，5.9μg／mL。化合物3還對巨噬細(xì)胞釋放TNF-α具有明顯的抑制作用，IC50為1.6μg／mL，優(yōu)于陽性藥物氫化可的松，以上結(jié)果為闡明腺梗豨薟抗風(fēng)濕的作用物質(zhì)基礎(chǔ)提供了實驗依據(jù)。

［1］中華人民共和國藥典委員會.中華人民共和國藥典［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005.

［2］趙凱華，趙烽，劉珂.腺梗豨薟提取物對脂多糖活化巨噬細(xì)胞釋放一氧化氮的抑制作用［J］.煙臺大學(xué)學(xué)報，2009，22（2）：137-140.

［3］ZHAO F，XU H，WANG L，et al.Inhibitory effects of sesquiterpenes from Saussurea lappa on the overproduction of nitric oxide and TNF-αrelease in LPS-activated macrophages［J］.J Asian Nat Prod Res，2008，10（11）：1045-53.

［4］高輝，李平亞，李德坤，等.腺梗豨薟的化學(xué)成分研究［J］.中草藥，2003，34（7）：597-598.

［5］李清華，張連龍，吳宗好.安徽貝母二萜成分的研究［J］.中國中藥雜志，1990，15（2）：170.

［6］王永學(xué)，陳正躍，邱培勇，等.大葉香茶菜中的三萜化學(xué)成分分析［J］.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2008，26（6）：550-552.

［7］鄒澄，張榮平，趙碧濤，等.紫菀活性酰胺研究［J］.云南植物研究，1999，21（1）：121-124.