楊東霞，吳修紅，叢慧芳，匡海學＊

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001；2.黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040）

子宮內(nèi)膜異位癥（endometriosis EMS）是一種常見的婦科疾病，主要指子宮內(nèi)膜在子宮腔被覆面以外的地方種植生長，是一種具有侵襲性的良性病變。其發(fā)病機制不清，最為推崇的是1972年Sampson等提出的經(jīng)血逆流、內(nèi)膜種植學說及機體免疫應答系統(tǒng)異常理論。大量實驗證實，逆流到腹腔的子宮內(nèi)膜可以在腹腔內(nèi)種植、生長。經(jīng)血逆流在生育期婦女非常普遍，發(fā)生率可高達90%，而EMs的患病率僅占20%左右［1］，因此推斷經(jīng)血逆流只是誘因，逆流入腹腔的內(nèi)膜組織必須降解基底膜和其他細胞外基質(zhì)（extracelluar-matrix.ECM）才能植入。而MMPs是ECM降解過程中最為重要的一組蛋白酶，幾乎能降解ECM的所有成分，是異位內(nèi)膜侵襲并種植于腹膜的關鍵。本研究通過體外實驗，探討少腹逐瘀湯對在位內(nèi)膜MMP-2和 MMP-9表達的影響。

1 資料與方法

1.1 研究對象及標本采集

原代培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜取自2007年7月-2010年7月在黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院因子宮肌腺癥伴盆腔子宮內(nèi)膜異位癥行子宮切除標本，年齡25～49歲，術前6個月未用激素治療，子宮切除后立即進行內(nèi)膜組織的刮取。

1.2 方法

（1）子宮內(nèi)膜細胞原代培養(yǎng)和傳代：參照Ryan等［5］方法，略有改動。將得到的子宮內(nèi)膜細胞接種于預先放置無菌玻片的6孔板和細胞培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)液用含10%胎牛血清的 DMEM／F12培養(yǎng)液（GIB-COL BRL產(chǎn)品），置于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中，每天觀察培養(yǎng)細胞的生長情況，待細胞融合成片后用0.25%胰酶消化傳代。

（2）不同濃度少腹逐瘀湯對子宮內(nèi)膜細胞 MMP-2和MMP-9的影響將子宮內(nèi)膜細胞接種于24孔板內(nèi)，培養(yǎng)3天后加少腹逐瘀湯含藥血清濃度分別為4%，8%，設不加少腹逐瘀湯含藥血清的細胞組作為對照。每組6孔，于加藥后72h檢測MMP-2和MMP-9。

（3）處理好的子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌后，加Trizol提取總RNA?？俁NA用DNaseⅠ消化處理后，采用逆轉錄試劑盒（TAKARA公司）將1μg純化的RNA逆轉錄合成cDNA。取反轉錄產(chǎn)物1μL，稀釋成10μL，作為反應的模板進行PCR擴增。實時熒光定量PCR采用從TaKaRa公司購置的SYBR Premix EX TaqTM，OPTICON2實時熒光定量PCR儀（MJ Research?）上進行。檢測中以對照組、少腹逐瘀湯含藥血清高劑量組、低劑量組cDNA為模板，分別擴增MMP-2和MMP-9基因及內(nèi)參基因GAPDH（引物序列見表1）。每個反應均設3次重復。反應條件：預變性95℃30s→熱循環(huán)95℃5s，58℃20s（共40個循環(huán)）。循環(huán)結果后，完成融解曲線，以檢驗PCR產(chǎn)物的純度。通過計算2-△△Ct值來確定該基因在不同濃度藥物處理下的相對表達量。

表1 目標基因及內(nèi)標基因GAPDH熒光定量PCR引物

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

少腹逐瘀湯含藥血清對細胞MMP-2和MMP-9表達的影響：對各濃度處理的細胞總RNA進行逆轉錄以及實時熒光定量PCR，分析藥物對細胞內(nèi)MMP-2mRNA和MMP-9mRNA的影響，計算少腹逐瘀湯含藥血清處理各組相對于對照組的MMP-2mRNA和 MMP-9mRNA表達水平，可見少腹逐瘀湯含藥血清對MMP-2mRNA和MMP-9mRNA的表達呈劑量依賴性抑制作用（P＜0.05），MMP-2基因分別下調(diào)表達0.8和0.39倍；MMP-9基因分別下調(diào)表達0.57和0.27倍。見圖1。

圖1 少腹逐瘀湯含藥血清對細胞MMP-2和MMP-9表達的影響

3 討論

子宮內(nèi)膜異位癥具有類似惡性腫瘤轉移侵襲的能力，在以往的腫瘤轉移侵襲研究中證明細胞外基質(zhì)（extracellularmatrix，ECM）及基底膜（basement membrane，BM）的降解和重塑在這個過程中主要依靠蛋白水解酶的作用，而基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）是其中最為重要的一組蛋白酶。MMPs是一個高度保守依賴于鋅離子的內(nèi)切蛋白水解酶家族，可降解ECM和BM的大多數(shù)蛋白［2］。目前發(fā)現(xiàn)的 MMPS有26余種 ，根據(jù)作用的特異性底物不同 ，可分為5大類：①間質(zhì)膠原酶 （MMP-1、MMP-8、MMP-13），底物主要為纖維性膠原 ；②明膠酶類（MMP-2、MMP-9），底物主要是明膠、IV／V型膠原 ；③間質(zhì)溶解素類 （MMP-3、MMP-7、MMP-10），底物主要是層粘連蛋白、纖維性蛋白、多糖核心蛋白及III、IV、XI型膠原；④膜型金屬酶類 （MMP-14、MMP-15、MM P-16、MMP-17），底物主要為I、II、III、IV 型膠原；⑤其它 （MMP-11、MMP-12），底物為al蛋白酶及彈性蛋白［3］。在正常穩(wěn)定狀態(tài)組織中MMPS表達極少，而在炎性細胞因子、激素、生長因子的刺激下以及細胞轉化過程中 ，其表達量上升 ，此過程涉及人體多種生理和病理過程 ，如炎癥、胚胎發(fā)生、血管形成及腫瘤侵襲轉移等。在人的正常子宮內(nèi)膜組織中，不同的MMPs在月經(jīng)周期中的表達不同，在月經(jīng)期及增殖早期，伴隨著內(nèi)膜組織的崩解和重建，MMPs呈高表達，而在分泌期，MMPs水平因受到孕激素的抑制而有所下降［4］。任何能夠導致MMPs和TIMPs表達失衡的原因，均可加快異位內(nèi)膜細胞外基質(zhì)的降解和重建，進而增進異位內(nèi)膜細胞的侵襲轉移，為異位內(nèi)膜細胞的增殖提供了前提條件。

少腹逐瘀湯源于清代王清任的《醫(yī)林改錯》，具有溫經(jīng)散寒、理氣止痛，并引諸藥直達少腹的功用，是臨床上治療子宮內(nèi)膜異位癥的常用方。為探討該方治療子宮內(nèi)膜異位癥的機理，本實驗通過觀察少腹逐瘀湯含藥血清對子宮內(nèi)膜異位癥在位內(nèi)膜細胞分泌的AMMP-2和MMP-9作用，結果發(fā)現(xiàn)少腹逐瘀湯能明顯抑制在位內(nèi)膜細胞MMP-2和MMP-9的分泌。從蛋白酶免疫角度，我們推測，少腹逐瘀湯可能通過免疫調(diào)節(jié)，抑制了內(nèi)異癥患者在位異常增高的MMP-2，9的表達及分泌，調(diào)節(jié)MMPs和TIMPs之間的平衡失調(diào)，降低了逆流至腹腔的內(nèi)膜其蛋白水解能力，使其種植能力下降，并減弱了其促血管內(nèi)皮細胞生成的功能，干擾了內(nèi)異癥形成的“3A”病理過程，減少了病灶的產(chǎn)生。這可能是少腹逐瘀湯控制內(nèi)異癥病情發(fā)展的機制之一。

［1］ANGER D L，F(xiàn)OSTER W G.The link between environmental toxieant exposure and endometriosis［J］.Front Biosci，2008，13：1578-1593.

［2］KAITU＇U TJ，SHEN J，ZHANG J，et al.Matrix metalloproteinases in endometrial breakdown and repair：functional significance in a mouse model［J］.Biol Reprod，2005，73（4）：672-680.

［3］CURRY JR TE，OSTEEN KG.Cyclic changes in the matrix metallo proteinase system in the ovary and uterus［J］.Biol Rep rod，2001，64：1285-1296.

［4］SIVRIDIS E，GIATROMANOLALI A.New insights into the normal menstrual cycle-regulatory molecules［J］.Histol Histopathol，2004，19（2）：511-516.