闞偉娟，喻婉瑩，于鵬霞，李敏敏，宋吉帥，趙 烽＊

（1.煙臺(tái)大學(xué) 藥學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264005；2.煙臺(tái)賽爾斯生物技術(shù)有限公司，山東 煙臺(tái) 264006）

芹菜素，化學(xué)結(jié)構(gòu)為5，7，4’-三羥基黃酮（見圖1），是芹菜中的主要生物活性成分，有“植物雌激素”之稱，廣泛存在于多種水果和蔬菜中，車前子、絡(luò)石藤、藿香等藥材中含有大量的芹菜素。研究表明，其具有抗氧化、清除自由基［1］、抗腫瘤、抗炎［2］等作用。鄂裘愷［3］以小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，灌胃法芹菜素給藥。阿司匹林為陽性對(duì)照藥，以醋酸所致扭體反應(yīng)為疼痛指標(biāo)，以二甲苯所致小鼠耳廓腫脹為炎癥指標(biāo)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：芹菜素高低劑量組均有鎮(zhèn)痛作用，芹菜素高劑量組與阿司匹林組相當(dāng)。各劑量組均有明顯的消炎作用，芹菜素高劑量優(yōu)于阿司匹林。以上結(jié)果提示芹菜素具有良好的鎮(zhèn)痛消炎臨床應(yīng)用價(jià)值。然而，芹菜素藥理學(xué)作用的研究大多尚處于動(dòng)物模型階段，作用機(jī)制仍不清楚。本研究利用LPS誘導(dǎo)體外炎癥模型，檢測(cè)芹菜素對(duì)LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞RAW 264.74釋放炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-6及NO的抑制作用，以及對(duì)iNOS、COX-2蛋白表達(dá)水平的影響，旨在探討芹菜素抗炎的分子機(jī)制。

圖1 芹菜素（Apigenin）結(jié)構(gòu)

1 材料與方法

1.1 材料

芹菜素（HPLC≥98%）由煙臺(tái)賽爾斯生物技術(shù)有限公司提供，以DMSO溶解、-20℃保存，使用前稀釋至指定濃度。RPMI 1640、胎牛血清購自Hyclone公司；LPS（Escherichia coli 0111：B4）、MTT購自Sigma公司；青霉素-鏈霉素雙抗溶液、0.25%胰酶消化液、小鼠TNF-αELISA試劑盒、小鼠IL-6ELISA試劑盒、一氧化氮檢測(cè)試劑盒為煙臺(tái)賽爾斯生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；Colorimetric COX Inhibitor Screening Assay Kit（760111），anti-murine iNOS polyclonal antibody，COX-2 （murine）polyclonal antibody購自 Cayman公司；β-actin antibody購自Santa Cruz Biotechnology，Inc。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及傳代

小鼠單核巨噬細(xì)胞株RAW 264.7購自中科院上海細(xì)胞庫（ATCC TIB-71）；用含10%胎牛血清、100μg·mL-1鏈霉素，100U·mL-1青霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液于37℃CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，隔天傳代，細(xì)胞于對(duì)數(shù)生長期呈半貼壁狀態(tài)生長。

1.3 NO濃度測(cè)定

按照文獻(xiàn)中所述的方法進(jìn)行測(cè)定［4］。

1.4 細(xì)胞體外生長活性檢測(cè)

采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞體外生長活性。吸取培養(yǎng)液上清100μL測(cè)定NO的濃度后，于上述96孔板內(nèi)每孔加入4μL MTT（終濃度200μg·mL-1），繼續(xù)培養(yǎng)4h后棄去上清，吸干殘留液，每孔加入DMSO 100μL，振搖至生成的藍(lán)紫色甲瓚結(jié)晶完全溶解后，以630nm為參比波長，用酶標(biāo)儀測(cè)定570nm處的吸光值（A570）。細(xì)胞生長抑制率（%）＝100×（1-實(shí)驗(yàn)組平均A570值／空白對(duì)照組平均A570值）。

1.5 ELISA法測(cè)定TNF-α、IL-6水平

取對(duì)數(shù)生長期的RAW 264.7細(xì)胞，用胰酶消化，制成每毫升含5×105個(gè)細(xì)胞的單細(xì)胞懸液，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（每孔200μL），每組設(shè)3個(gè)平行孔。培養(yǎng)1h后分別加入不同濃度的芹菜素及LPS（終濃度1μg·mL-1），同時(shí)設(shè)LPS組和空白對(duì)照組，置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6h后收集細(xì)胞上清液，按照相應(yīng)的ELISA試劑盒說明書方法進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-6的濃度［5］。

1.6 比色法測(cè)定COX-2酶活性

每個(gè)樣品設(shè)兩個(gè)平行孔，按照說明書方法進(jìn)行測(cè)定。

1.7 Western Blotting法檢測(cè)iNOS、COX-2及內(nèi)參蛋白β-actin表達(dá)水平

取RAW 264.7細(xì)胞接種于60mm培養(yǎng)皿，37℃培養(yǎng)1h后給藥，同時(shí)設(shè)空白組、LPS組。培養(yǎng)24h后，收集細(xì)胞，超聲破碎提取總蛋白，采用Bradford法進(jìn)行定量。取30μg總蛋白行12%SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉4℃封閉過夜，T-TBS洗膜3次，加入一抗溶液4℃孵育2h，用相同方法洗膜，加入HRP標(biāo)記的二抗溶液4℃孵育1h，相同方法洗膜后加入ECL發(fā)光劑，放入暗盒中壓片、顯影、定影。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 芹菜素對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞釋放NO的抑

空白組細(xì)胞上清中檢測(cè)到的NO濃度非常低，僅為0.47μmol·L-1，在1μg·mL-1的LPS刺激下，巨噬細(xì)胞釋放出大量的NO（12.39μmol·L-1），經(jīng)3～4次重復(fù)實(shí)驗(yàn)表明兩組間有顯著性差異，P＜0.01，表明LPS能明顯誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞釋放大量炎性介質(zhì)NO。與LPS組相比，經(jīng)芹菜素作用的RAW 264.7細(xì)胞上清液中，NO的含量明顯減少，隨著用藥濃度的增高NO的濃度逐漸降低，呈現(xiàn)出良好的劑量依賴關(guān)系。50～100μmol·L-1芹菜素能夠完全抑制LPS誘導(dǎo)的NO釋放，25μmol·L-1芹菜素能夠顯著抑制LPS誘導(dǎo)的NO釋放，作用強(qiáng)度與100μmol·L-1抗炎藥物氫化可的松相當(dāng)，結(jié)果見圖2。

2.2 芹菜素對(duì)RAW 264.7細(xì)胞增殖無顯著影響

芹菜素在12.5～100μmol·L-1濃度范圍內(nèi)，對(duì)RAW 264.7細(xì)胞的正常增殖均無明顯抑制作用，高濃度下（100μmol·L-1）作用24h后，給藥組細(xì)胞的存活率為99.80%，無細(xì)胞毒性。

2.3 芹菜素對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞釋放IL-6水平的影響

如表1所示，空白對(duì)照組細(xì)胞上清液中IL-6的濃度為190.15pg·mL-1，經(jīng)過1μg·mL-1的LPS刺激6h后，細(xì)胞釋放大量的IL-6，此時(shí)上清液中IL-6的濃度為1526.62 pg·mL-1，與空白組比較有顯著性差異，P＜0.05。不同濃度的芹菜素可以極為顯著地抑制LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞釋放IL-6，P＜0.05。

圖2 芹菜素對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞釋放NO的抑制作用

表1 芹菜素對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞釋放IL-6的抑制作用

2.4 芹菜素對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞釋放TNF-α的影響

如表2所示，空白對(duì)照組細(xì)胞上清液中TNF-α的濃度為7.23pg·mL-1，經(jīng)過1μg·mL-1的LPS刺激6h后，細(xì)胞釋放大量的 TNF-α，此時(shí)上清液中 TNF-α的濃度為4943.85pg·mL-1，與空白組比較有顯著性差異，P＜0.01。12.5～100μmol·L-1的芹菜素可以顯著抑制LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞釋放TNF-α，作用強(qiáng)度優(yōu)于陽性對(duì)照藥物氫化可的松。

表2 芹菜素對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞釋放TNF-α的抑制作用

2.5 芹菜素對(duì)COX-2酶活力的影響

以純化的COX-2酶活力值為100，芹菜素在0.125～1mmol·L-1濃度范圍內(nèi)對(duì)COX-2酶活力無明顯抑制作用。而陽性對(duì)照藥物1mmol·L-1氫化可的松可使COX-2酶活力明顯降低，P＜0.01，結(jié)果見圖3。

圖3 芹菜素對(duì)COX-2酶活力的影響

2.6 芹菜素對(duì)iNOS、COX-2蛋白表達(dá)的抑制作用

如圖4所示，以 Western blot法檢測(cè)iNOS、COX-2及內(nèi)參蛋白β-actin的水平，結(jié)果表明正常細(xì)胞中幾乎不表達(dá)iNOS和COX-2蛋白，經(jīng)過1μg·mL-1的LPS刺激24h后，iNOS和COX-2的蛋白水平顯著升高。高濃度芹菜素可以輕微抑制LPS誘導(dǎo)的iNOS蛋白表達(dá)升高，但是對(duì)COX-2蛋白水平升高無明顯抑制作用。

圖4 芹菜素對(duì)LPS誘導(dǎo)iNOS和COX-2蛋白表達(dá)升高的抑制作用

3 討論

芹菜素及其制劑作為抗炎中藥制劑，在臨床上得以廣泛應(yīng)用，但其作用機(jī)理尚未充分闡明。本研究針對(duì)芹菜素對(duì)LPS誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞釋放NO、IL-6及TNF-α等炎癥因子的抑制作用進(jìn)行了研究，結(jié)果表明芹菜素能顯著抑制LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞分泌NO、IL-6和TNF-α等炎性因子，并且對(duì)iNOS蛋白表達(dá)也有抑制作用。由此可以明確芹菜素是通過下調(diào)iNOS蛋白表達(dá)，抑制巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO、IL-6和TNF-α等炎性細(xì)胞因子從而發(fā)揮抗炎作用。

［1］文赤夫，董愛文，羅慶華，等.紫花地丁中芹菜素提取和清除自由基活性研究［J］.現(xiàn)代食品科技，2006，22（1）：20-25.

［2］隋海霞，徐海濱，蔭士安.芹菜素的生物學(xué)作用［J］.國外醫(yī)學(xué)·衛(wèi)生學(xué)分冊(cè)，2008，35（2）：103-107.

［3］鄂裘愷，謝煥松，周鳴鳴.芹菜素鎮(zhèn)痛消炎作用研究［J］.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，10（7）：145-146.

［4］趙凱華，趙烽，劉珂.腺梗豨薟提取物對(duì)脂多糖活化巨噬細(xì)胞釋放一氧化氮的抑制作用［J］.煙臺(tái)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)與工程版，2009，22（2）：137-140.

［5］ZHAO F，XU H，WANG L，JIANG YT，Liu K.Inhibitory effects of sesquiterpenes from Saussurea lappa on the overproduction of nitric oxide and TNF-αrelease in LPS-activated macrophages［J］.Asian Nat Prod Res，2008，10（11）：1045-1053.