馮善濤，李立煌，任 利

（福建中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，福建 福州 350108）

桂枝甘草湯出自張仲景《傷寒論》，是溫心陽(yáng)，養(yǎng)心氣的祖方。方中以桂枝辛甘發(fā)散溫通心陽(yáng)，以炙甘草甘緩補(bǔ)虛溫養(yǎng)心氣［1，2］。原書(shū)用于治療“發(fā)汗過(guò)多，其人叉手自冒汗，心下悸欲得按者”，現(xiàn)臨床多用于治療緩慢性心律失常，文獻(xiàn)報(bào)道效果肯定［3-6］。本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)復(fù)制心陽(yáng)虛心動(dòng)過(guò)緩大鼠模型，觀察桂枝甘草湯對(duì)試驗(yàn)大鼠心率的影響，并通過(guò)檢測(cè)試驗(yàn)大鼠Gsα蛋白含量，探討其作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器

生理儀，BL-420，成都泰盟科技有限公司；BIOFUGE全能臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)；酶標(biāo)儀，Bio-Tek ELX800光吸收；電泳儀、半干法轉(zhuǎn)膜儀、化學(xué)發(fā)光成像儀，BIO-RAD。

1.2 藥品與試劑

普萘洛爾片，陜西云鵬制藥有限公司，批號(hào)B 080901；心寶丸，廣東省藥物研究所制藥廠；桂枝、甘草，購(gòu)自福建省藥材公司，經(jīng)鑒定桂枝為正品；生理鹽水，福州海王福藥制藥有限公司，批號(hào)090822A04；細(xì)胞膜蛋白與細(xì)胞漿蛋白提取試劑盒、Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒、超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、Tubulin抗體、山羊抗小鼠IgG均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；Gsα蛋白抗體，美國(guó)abcam 公司，編號(hào)ab83735；羊抗兔IgG，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，編號(hào)ZDR-5306。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠60只，體重（200±20）g，雌雄各半，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司；普通飼料，福建中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心提供。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雌、雄分籠，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，分別隨機(jī)分為空白組（K）、模型組（普萘洛爾90mg·kg-1）（M）、心寶對(duì)照組（劑量83mg·kg-1）（X）、和桂枝甘草湯高劑量組（2.4g·kg-1）（G）、中劑量組（1.2g·kg-1）（Z）、低劑量組（0.6g·kg-1）（D）。除空白組外，各組大鼠上午灌胃普萘洛爾（90mg·kg-1），下午分別灌胃生理鹽水、心寶和各劑量的桂枝甘草湯，1次／d，連續(xù)7天。

2.2 一般體征檢測(cè)

設(shè)定大鼠便狀、扎堆、毛皮、神態(tài)、卷曲拱背、尾涼、體重、反應(yīng)靈敏度8項(xiàng)體征評(píng)價(jià)指標(biāo)，視各項(xiàng)指標(biāo)對(duì)心陽(yáng)虛診斷意義相同，每項(xiàng)指標(biāo)，按輕重程度分為Ⅰ級(jí)1分、Ⅱ級(jí)2分、Ⅲ級(jí)3分。設(shè)每項(xiàng)指標(biāo)7日總平均值為其終值，8項(xiàng)指標(biāo)終值相加得累積分。設(shè)心陽(yáng)虛程度為Y值，累積分為L(zhǎng)值，Y＝L／8。給藥期間，每日給藥前專(zhuān)人觀察評(píng)價(jià)各項(xiàng)指標(biāo)并記錄。

2.3 心率檢測(cè)

于灌胃結(jié)束當(dāng)日始，禁食24h，除桂枝甘草湯組及心寶組分別灌胃對(duì)應(yīng)劑量藥物，其它組灌胃生理鹽水，2h后，10%水合氯醛3mL·kg-1腹腔注射麻醉，生理儀測(cè)各鼠心電圖，持續(xù)5min，記錄各鼠心率。

2.4 竇房結(jié)Gsα蛋白含量測(cè)定

于心臟界嵴部靜脈竇側(cè)、前腔靜脈根部，取100mg的心肌組織塊，參照細(xì)胞膜蛋白與細(xì)胞漿蛋白提取試劑盒使用說(shuō)明抽取膜蛋白，Bradford法定量蛋白濃度；參照凝膠配置試劑盒使用說(shuō)明配制10%分離膠，5%濃縮膠；按照每4μL蛋白樣品加入1μL蛋白上樣緩沖液（5X）的比例，混合蛋白樣品和蛋白上樣緩沖液（5X）。100℃或沸水浴加熱3～5min，以充分變性蛋白。冷卻到室溫后，直接上樣到SDSPAGE膠加樣孔內(nèi)即可。以PBS和5X蛋白上樣緩沖液調(diào)配蛋白樣本濃度為10μg·μL-1，100℃加熱10min，按照每4微升蛋白樣品加入1微升蛋白上樣緩沖液（5X）的比例，混合蛋白樣品和蛋白上樣緩沖液（5X）。100℃或沸水浴加熱3～5min，以充分變性蛋白。冷卻到室溫后，直接上樣到SDSPAGE膠加樣孔內(nèi)即可。冷卻至室溫后；每個(gè)樣本平行上樣兩塊膠（樣本膠與復(fù)本膠），每塊膠上樣♀K、♀G、♀Z、♀D、♀M或♂K、♂G、♂Z、♂D、♂M，每孔上樣10μL；80V、20min濃縮，100V、60min分離；樣本膠與復(fù)本膠均15V、45min半干法轉(zhuǎn)膜；封閉液（含5%脫脂奶粉，0.5%Tween-TBS）室溫非特異性封閉2h；樣本膜加Gsα蛋白抗體（按滴度1：100稀釋?zhuān)?fù)本膜加Tubulin抗體（按滴度1：1000稀釋?zhuān)?℃過(guò)夜；0.5%Tween-TBS清洗2次，TBS清洗一次；分別加入羊抗兔IgG（按滴度1：10000稀釋?zhuān)?、山羊抗小鼠IgG（按滴度1：1000稀釋?zhuān)┦覝胤?h；0.5%Tween-TBS清洗2次，TBS清洗1次；加ECL試劑，化學(xué)發(fā)光成像儀ChemiDoc XRS系統(tǒng)成像，Quantity One圖像分析軟件分析各蛋白條帶灰度。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 桂枝甘草湯對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠一般體征的影響

表1 實(shí)驗(yàn)大鼠一般體征統(tǒng)計(jì) （m±s）

如表1所示，模型組大鼠心陽(yáng)虛程度明顯高于空白組；桂枝甘草湯各劑量組大鼠心陽(yáng)虛程度均明顯低于模型組；中、高劑量桂枝甘草湯組大鼠心陽(yáng)虛程度與空白組比較無(wú)明顯差異。

3.2 桂枝甘草湯對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠心率的影響

如表2所示，模型組大鼠心率明顯低于空白組；桂枝甘草湯各劑量組大鼠心率均明顯高于模型組；中、高劑量桂枝甘草湯組大鼠心率與空白組、心寶組比較均無(wú)明顯差異。

3.3 桂枝甘草湯對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠竇房結(jié)Gsα蛋白表達(dá)的影響

如表3所示，模型組大鼠竇房結(jié)Gsα蛋白含量明顯低于空白組，各劑量桂枝甘草湯組大鼠竇房結(jié)Gsα蛋白含量均明顯高于模型組，低劑量桂枝甘草湯組大鼠竇房結(jié)Gsα蛋白含量與空白組無(wú)明顯差異性，中、高劑量桂枝甘草湯組大鼠竇房結(jié)Gsα蛋白含量明顯高于空白組。

表2 實(shí)驗(yàn)大鼠心率 （次／min，m±s）

表3 實(shí)驗(yàn)大鼠竇房結(jié)Gsα蛋白含量 （%）

圖1 實(shí)驗(yàn)大鼠竇房結(jié)Gsα蛋白

圖2 實(shí)驗(yàn)大鼠竇房結(jié)復(fù)本膠內(nèi)參Tubulin

4 討論

竇房結(jié)Gsα蛋白含量的高低對(duì)起搏細(xì)胞離子通道蛋白活性及心率的調(diào)控具有重要的作用。Gsα蛋白，即刺激性鳥(niǎo)苷酸結(jié)合調(diào)節(jié)蛋白，是細(xì)胞內(nèi)一類(lèi)重要的信號(hào)傳導(dǎo)蛋白。作為耦聯(lián)與細(xì)胞表面受體和細(xì)胞內(nèi)效應(yīng)器的橋梁，是調(diào)節(jié)心臟功能的主要因素［7］。在竇房結(jié)神經(jīng)血管內(nèi)皮細(xì)胞受體-腺苷酸環(huán)化酶（AC）信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)中，G蛋白以Gαβγ復(fù)合體的形式與受體和作為效應(yīng)器的起搏細(xì)胞離子通道蛋白共同定位在細(xì)胞膜上。當(dāng)交感神經(jīng)興奮時(shí)，腎上腺激素受體被激活，并與Gαβγ復(fù)合體相互作用，使Gsα亞基游離；游離的Gsα蛋白介導(dǎo)PKA（cAMP依賴(lài)蛋白激酶）激活，促進(jìn)cAMP的合成，并通過(guò)cAMP介導(dǎo)HCN（環(huán)核苷酸門(mén)控）、Cav1、K等離子通道磷酸化，增加通道活性，增加If、ICa-L、IK等；進(jìn)而引發(fā)動(dòng)作各相電位變化、竇房結(jié)自律性和激動(dòng)能力提高等一系列心率正性效應(yīng)［8］。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，桂枝甘草湯能明顯提高心動(dòng)過(guò)緩大鼠的心率，對(duì)正常大鼠心率無(wú)明顯影響，作為心臟功能調(diào)節(jié)主要因素的Gsα蛋白隨桂枝甘草湯劑量增加持續(xù)增加，桂枝甘草湯對(duì)大鼠竇房結(jié)Gsα蛋白含量的調(diào)節(jié)是其治療心動(dòng)過(guò)緩的機(jī)制之一。

［1］王秋，王占石.桂枝甘草湯溫經(jīng)通脈的藥效學(xué)研究［J］.中醫(yī)藥研究，2002，18（5）：41-42.

［2］呂英，高潔.桂枝甘草湯“辛甘化陽(yáng)”配伍的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中藥材，2010，33（8）：1297-1299.

［3］洪麗生，劉長(zhǎng)節(jié).桂枝甘草湯加減治療心血管疾病療效觀察［J］.福建醫(yī)藥雜志，2006，27（2）：149-150.

［4］黃海.試論經(jīng)方的雙向調(diào)節(jié)作用［J］.江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2000，12（1）：26-27.

［5］黃海.桂枝甘草湯加減治療心血管病［J］.中醫(yī)雜志，2005，46（1）：71.

［6］郭翠萍.淺談桂枝湯類(lèi)方的雙向調(diào)節(jié)作用［J］.中國(guó)醫(yī)藥衛(wèi)生，2005，6（17）：121-122.

［7］周元國(guó)，王正國(guó)，朱佩.G蛋白在心臟功能調(diào)節(jié)中的作用蛋白在心血管功能調(diào)節(jié)及急性肺損傷中的作用研究［J］.第三軍醫(yī)大學(xué)報(bào)，1997（2）：159-162.

［8］齊普斯（美），賈萊夫（美）.郭繼鴻，李學(xué)斌，譯.心臟電生理：從細(xì)胞到臨床［M］.北京：北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社，2008.