何書海 （信陽農(nóng)業(yè)高等?？茖W(xué)校動(dòng)物科學(xué)系 河南 信陽 464000）

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兔愛美耳球蟲病的快速病理診斷

何書海 （信陽農(nóng)業(yè)高等?？茖W(xué)校動(dòng)物科學(xué)系 河南 信陽 464000）

愛美耳球蟲在臨床上常常引起雞球蟲病和兔球蟲病，檢查該病時(shí)常產(chǎn)采用病理剖檢和實(shí)驗(yàn)室檢查來確診。愛美耳球蟲感染雞時(shí)，球蟲常常寄生在腸黏膜上，出現(xiàn)以球蟲腸炎為主的病變特征，其球蟲合子可以隨糞便排出體外，所以通過檢查糞便就可以比較容易的確診該病。而當(dāng)發(fā)生兔球蟲病特別是肝型球蟲時(shí)，球蟲主要寄生在肝膽管上，發(fā)生以球蟲肝炎為主要特征的病變，此時(shí)就不能單純根據(jù)糞檢發(fā)現(xiàn)卵囊就確診為球蟲病。一方面是因?yàn)樵诩毙郧蛳x病時(shí)，如處于裂體增殖期時(shí)尚未形成卵囊，有時(shí)糞檢不一定發(fā)現(xiàn)卵囊。另一方面是兔的帶蟲現(xiàn)象極為普遍。實(shí)踐證明，糞便中的卵囊檢查要和尸檢同時(shí)進(jìn)行，特別是病變部制作切片鏡檢是診斷球蟲病的重要手段。由于傳統(tǒng)石蠟切片檢查相對(duì)糞檢來說較費(fèi)時(shí)費(fèi)力，所以在臨床檢查時(shí)很少被運(yùn)用。本試驗(yàn)結(jié)合病理剖檢技術(shù)，通過對(duì)傳統(tǒng)石蠟切片技術(shù)進(jìn)行改良和創(chuàng)新，探索出了一種便捷的病理檢查方法，以期為臨床快速確診兔愛美耳球蟲病提供實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。

1 臨床診斷材料與設(shè)備

患病家兔及其肝、腸病變組織。54~58℃石蠟、硬脂酸、無水乙醇、二甲苯、蘇木素染色液、伊紅染色液等，以上所涉及化學(xué)藥品均為分析純。

SK生物組織快速處理儀(上海隆拓儀器設(shè)備有限公司)，KD-3368-VI電腦冷凍石蠟兩用切片機(jī)(浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司)，OLYMPUS CHC型光學(xué)顯微鏡(日本OLYMPUS光學(xué)工業(yè)株式會(huì)社)，MD90 數(shù)碼成像裝置(廣州明美科技有限公司)。

2 臨床診斷方法

2.1 病理剖檢 對(duì)病死家兔進(jìn)行尸體解剖，檢查內(nèi)臟器官，采取病變器官進(jìn)行保存?zhèn)錂z。

2.2 快速切片檢查 取肝臟以及小腸組織快速制作石蠟切片，并染色鏡檢。具體方法如下：（1）準(zhǔn)備100ml具塞廣口瓶6個(gè)，分別盛入AF固定液、85%酒精、95%酒精、100%酒精、混合石蠟(硬脂酸與54℃石蠟按1:3混合)。（2）取肝臟、小腸病理組織切成1.0cm×1.0cm×0.3cm大小，放入100ml具塞廣口瓶，置于SK生物組織快速處理儀中超聲處理(水溫75℃，超聲頻率1MHz，超聲時(shí)間根據(jù)組織大小選擇3~5min)，依次完成固定、脫水、透明、浸蠟。（3）取事先預(yù)制蠟塊(熔點(diǎn)56~58℃)，用彎頭鑷子在中央融化與組織大小相同的坑，放入組織塊，熱蠟固封，冰箱4℃迅速冷卻1min。（4）迅速切片，撈片后，將載玻片反面放在酒精燈上加熱至70℃左右融蠟，濾紙吸蠟后再次加熱入二甲苯1min脫蠟。（5）無水酒精浸洗15s，95%酒精浸洗15s，滴加蘇木素染色液于玻片組織上，并酒精燈加熱至表面有熱氣散發(fā)。(6）水洗2次后75%鹽酸反藍(lán)，水洗后入95%乙醇，再進(jìn)行伊紅染色，水洗后進(jìn)入80%、95%、100%濃度酒精梯度脫水各1min。（6）二甲苯透明2次，中性樹膠封片、鏡檢。

3 結(jié)果

剖檢可見部分病死兔肝臟明顯腫大，沿小膽管分布上有黃白色小結(jié)節(jié)，有的病灶中的內(nèi)容物變稠，形成粉粒樣的鈣化物，膽囊脹大，膽汁濃稠；腸壁血管充血，腸腔臌氣，十二指腸擴(kuò)張、肥厚，黏膜有出血性炎癥；部分表現(xiàn)為腸壁有栗粒大小的黃白色結(jié)節(jié)以及小的化膿性、壞死性病灶。

顯微鏡下觀察肝小葉間結(jié)締組織增生，并形成包囊，內(nèi)含大量球蟲蟲卵；肝細(xì)胞脂肪變性、萎縮，肝索明顯變細(xì)，肝血竇顯著變大，肝膽管擴(kuò)張，膽管上皮細(xì)胞內(nèi)和管腔內(nèi)有許多裂殖體、裂殖子、配子體、孢子囊等不同發(fā)育期的蟲體(圖1)。鏡檢小腸可見腸黏膜上皮細(xì)胞變性、壞死和脫落，黏膜上皮內(nèi)見有裂殖體，腸腔部位可見球蟲卵囊(圖2)。該方法制作的切片HE染色著色好，細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核紅藍(lán)對(duì)比鮮明，細(xì)胞無變形、空泡化等異?，F(xiàn)象。

圖1 肝球蟲H.E400′

圖2 腸球蟲H.E400′

3 討論

兔球蟲病是兔業(yè)養(yǎng)殖中一種常見且危害嚴(yán)重的寄生蟲病，該病是由艾美耳屬的多種球蟲寄生于兔的小腸或膽管上皮細(xì)胞內(nèi)引起的，病兔死亡率很高，該病常造成兔業(yè)養(yǎng)殖的巨大損失。發(fā)生該病時(shí)，特別是肝型兔球蟲病時(shí)，診斷該病僅靠糞便檢查發(fā)現(xiàn)卵囊來確診是不夠的，所以需要采取病理剖檢并結(jié)合實(shí)驗(yàn)室病理組織切片檢查來確診本病。本試驗(yàn)通過對(duì)傳統(tǒng)石蠟切片技術(shù)進(jìn)行改良和創(chuàng)新，探索了一種快捷的兔球蟲病的快速病理診斷技術(shù)，并取得了良好的試驗(yàn)結(jié)果，值得推廣。

本試驗(yàn)根據(jù)超聲波可以使分子高速振動(dòng)、運(yùn)動(dòng)加快的原理，運(yùn)用SK生物組織快速處理儀發(fā)射的超聲波對(duì)病理組織進(jìn)行脫水、透明、浸蠟處理，縮短病理組織的處理時(shí)間，使整個(gè)制作過程簡便而快捷。在一定溫度下，超聲波強(qiáng)大的穿透力作用使病理組織中的液體分子與試劑溶液交換加速，從而加快了固定、脫水、透明和浸蠟的速度。本方法成功實(shí)現(xiàn)了病理切片檢查時(shí)間的縮短并獲得高質(zhì)量的檢查效果，將傳統(tǒng)石蠟切片制作時(shí)間從30h縮短為20~30min，為實(shí)現(xiàn)該方法在實(shí)驗(yàn)室檢查中的廣泛推廣奠定了良好的技術(shù)基礎(chǔ)。同時(shí)，在實(shí)踐該病理切片檢查方法時(shí)，體會(huì)出了一些關(guān)鍵注意事項(xiàng)，以保證切片效果，現(xiàn)總結(jié)如下：（1）取材時(shí)應(yīng)盡量取的薄，便于組織脫水；（2）處理過程中應(yīng)根據(jù)不同組織來選擇時(shí)間，注意觀察處理后的組織變化；（3）包埋時(shí)，蠟塊中的坑不可事先做好，這樣組織在切片時(shí)會(huì)出現(xiàn)脫落的現(xiàn)象，同時(shí)還要注意將組織包埋得平整；（4）用濾紙吸蠟時(shí)，不應(yīng)太用力，已用過的地方，切不可反復(fù)使用，否則很容易脫片；（5）在載玻片反面加熱融蠟和染色時(shí)，也可以選用電吹風(fēng)，但都要注意溫度的控制，不宜過高，以免在染色時(shí)出現(xiàn)脫片和細(xì)胞過度收縮；（6）操作時(shí)，操作人員的熟練程度會(huì)直接影響到全程的時(shí)間長短。

（2011–10–27）

S858.291

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1007-1733(2012)01-0038-02