邵 雙， 丁 淼， 關(guān)麗杰

(沈陽(yáng)化工大學(xué)制藥與生物工程學(xué)院，遼寧沈陽(yáng) 110142)

L-抗壞血酸(即維生素C，VC)為水溶性維生素，其作為酸性藥劑、還原劑、抗氧化劑、漂白劑以及化學(xué)反應(yīng)物、食品和飲料中的穩(wěn)定劑［1］被廣泛使用.臨床上主要用于防治壞血病和傳染病，促進(jìn)創(chuàng)傷愈合，是作為輔助治療的保健藥品.在化妝品中可作為還原劑、紫外線吸收劑和黑色素形成抑制劑.但L-抗壞血酸還原性強(qiáng)，極不穩(wěn)定，極易被熱和氧化劑破壞，尤其是光、重金屬和熒光物質(zhì)能促進(jìn)其氧化［2］，使其在應(yīng)用方面受到很大限制.因此，如何增強(qiáng)穩(wěn)定性是其應(yīng)用時(shí)急需解決的首要問題.近期，人們致力于L-抗壞血酸的衍生物研究，試圖找出既具有L-抗壞血酸的作用，又具有高穩(wěn)定性的衍生物.2-氧-α-D-吡喃型葡萄糖基抗壞血酸(AA-2G)是由日本林原生物化學(xué)研究所與岡山大學(xué)藥學(xué)系共同發(fā)現(xiàn)的，其具有更高的穩(wěn)定性及抗氧化性，同時(shí)更易于吸收和利用［3-6］.AA-2G的化學(xué)合成十分困難，而采用糖基轉(zhuǎn)移酶，如α-葡萄糖苷酶、環(huán)麥芽糊精聚糖轉(zhuǎn)移酶等［7］，可將糖及供體的D-吡喃型葡萄糖基部分轉(zhuǎn)移到L-抗壞血酸的2-碳位置的羥基基團(tuán)上脫水生成AA-2G，該生物轉(zhuǎn)化法是生產(chǎn)AA-2G可行途徑.然而迄今，我國(guó)對(duì)大量生產(chǎn)AA-2G的技術(shù)尚不成熟，本文對(duì)提高AA-2G合成效率的方法進(jìn)行探討.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

供試菌種為沈陽(yáng)化工大學(xué)生物工程實(shí)驗(yàn)室篩選并保藏的環(huán)麥芽糊精聚糖轉(zhuǎn)移酶產(chǎn)酶菌種SHⅢA，該菌種為反硝化利斯特氏菌.菌種培養(yǎng)基為:可溶性淀粉 20 g，蛋白胨 5 g，Mg2SO4·7H2O 0.1 g，K2HPO40.5 g，Na2CO32 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 7.平板培養(yǎng)基加瓊脂7 g/L.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 環(huán)麥芽糊精聚糖轉(zhuǎn)移酶酶活測(cè)定

菌種發(fā)酵液以4 000 r/min離心20 min，取上清液即為粗酶.取10 μL稀釋10倍的酶液，加入0.2 mol/mL甘氨酸-NaOH-NaCl緩沖液(pH8.55)0.2 mL，再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%的可溶性淀粉液0.2 mL，振蕩，于40℃水浴反應(yīng)10 min，立即加入0.5 mL 0.5 mol/mL醋酸溶液終止反應(yīng)，然后加入3 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.005%的碘液顯色，同時(shí)以蒸餾水為空白，不加酶液為對(duì)照，于700 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(OD值).使吸光度下降10%的酶量定義為一個(gè)酶活單位.按以下公式計(jì)算:

式中a為對(duì)照組的吸光度，b為樣品的吸光度

1.2.2 AA-2G的合成方法

在預(yù)先放好質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%硫脲2 mL的試管中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的L-抗壞血酸溶 液10 mL、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的 α-環(huán)糊精10 mL、發(fā)酵上清液20 mL，調(diào)節(jié)pH為6，抽真空后將試管放入恒溫?fù)u床中，在200 r/min、上蓋錫紙、45℃條件下反應(yīng)20 h.反應(yīng)結(jié)束后加入1 mmol/L的 CuSO4溶液0.2 mL，以除去未反應(yīng)的殘余L-抗壞血酸，100℃滅酶2 min.

1.2.3 AA-2G含量測(cè)定

標(biāo)準(zhǔn)加入法.采用稀釋適當(dāng)倍數(shù)的待測(cè)反應(yīng)液配制L-抗壞血酸的系列梯度濃度溶液，以此為標(biāo)準(zhǔn)溶液，于700 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(OD值)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.

1.2.4 菌種產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

菌種采用1.1中的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，分別針對(duì)菌種培養(yǎng)的碳源、氮源、金屬離子、pH值、溫度、接種量、培養(yǎng)時(shí)間7個(gè)因素，設(shè)計(jì)單因子實(shí)驗(yàn)，重復(fù)3次，培養(yǎng)后測(cè)定菌懸液中環(huán)麥芽糊精聚糖轉(zhuǎn)移酶酶活，探知最佳菌種產(chǎn)酶條件.碳源分別采用可溶性淀粉、糊精、葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、果糖，每種碳源均取20 g/L，替代1.1培養(yǎng)基中的可溶性淀粉.

氮源采用硫酸銨、氯化銨、酵母膏、蛋白胨、硝酸鉀、尿素，每種氮源的含氮量相當(dāng)于5 g/L蛋白胨，替代1.1培養(yǎng)基中的蛋白胨.

在前述確定的最佳培養(yǎng)基中分別添加Ca2+、Mn2+、Co2+、Fe2+、Cu2+、Fe3+、Zn2+、Na+、K+的硝酸鹽或硫酸鹽，濃度均為0.5 mmol/L，以考察金屬離子對(duì)產(chǎn)酶活性的影響.

在培養(yǎng)6～96 h范圍內(nèi)，間隔6 h連續(xù)測(cè)定酶活，探知最佳菌種培養(yǎng)時(shí)間.

分別設(shè)置培養(yǎng)基的 pH 為 6、7、8、9、10、11、12、13，探知最佳 pH 值.

分別設(shè)置培養(yǎng)溫度為 20、25、30、35、40、45℃，探知最佳培養(yǎng)溫度.

分別設(shè)置接種量為6%、8%、10%、12%、15%、20%進(jìn)行菌株發(fā)酵，測(cè)定酶活以確定最佳培養(yǎng)條件.

1.2.5 AA-2G的合成條件優(yōu)化

產(chǎn)酶菌種采用1.2.4確定的最佳條件進(jìn)行培養(yǎng)，菌懸液離心上清液為環(huán)麥芽糊精聚糖轉(zhuǎn)移酶粗酶液，以L-抗壞血酸為底物合成AA-2G.設(shè)計(jì)單因子實(shí)驗(yàn)，3次重復(fù)，考察反應(yīng)溫度、糖基供體的種類、L-抗壞血酸的濃度、反應(yīng)時(shí)間及底物與糖基供體的濃度比對(duì)AA-2G合成的影響.

反應(yīng)溫度分別設(shè)置為 20、25、30、35、40、45℃，以確定最佳溫度.

糖基供體分別選用糊精、麥芽糖、羧甲基纖維素鈉、β-環(huán)糊精、玉米淀粉，以確定底物.

VC質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別設(shè)置為2%、6%、10%、14%、18%、22%、26%，以確定最佳質(zhì)量分?jǐn)?shù).

在確定VC最佳質(zhì)量分?jǐn)?shù)基礎(chǔ)上，采用最佳糖基供體，設(shè)置VC與糖基供體的質(zhì)量比率分別為 1∶0.5、1∶0.75、1∶1、1∶1.5、1∶2.

反應(yīng)時(shí)間分別設(shè)置為 20、30、44、54、68 h.測(cè)定AA-2G的含量，探明AA-2G最佳合成條件.

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

2.1.1 碳源對(duì)菌種產(chǎn)酶活性的影響

分別采用7種碳源培養(yǎng)菌種后測(cè)定酶活，結(jié)果繪于圖1.由圖1可知:麥芽糖為碳源時(shí)酶活最高，達(dá)513 U/mL，其次為果糖和蔗糖，采用葡萄糖時(shí)酶活僅為63 U/mL.故在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中均采用麥芽糖為碳源.

圖1 碳源種類對(duì)菌種產(chǎn)環(huán)麥芽糊精聚糖轉(zhuǎn)移酶活性的影響Fig.1 Effect of carbon source on CGTase activity produced by the given bacteria

2.1.2 氮源對(duì)菌種產(chǎn)酶活性的影響

分別采用6種氮源進(jìn)行菌種培養(yǎng)后測(cè)定酶活，結(jié)果繪于圖2.由圖2可知:蛋白胨為氮源時(shí)酶活最高，達(dá)1 200 U/mL，其次為硫酸銨和氯化銨，采用尿素時(shí)酶活僅為619 U/mL.故在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中均采用蛋白胨為氮源.

圖2 氮源對(duì)菌種產(chǎn)環(huán)麥芽糊精聚糖轉(zhuǎn)移酶活性的影響Fig.2 Effect of nitrogen source on CGTase activity produced by the given bacteria

2.1.3 金屬離子對(duì)菌種產(chǎn)酶活性的影響

在培養(yǎng)基中分別添加9種金屬離子進(jìn)行菌種培養(yǎng)后測(cè)定酶活，結(jié)果繪于圖3.

圖3 金屬離子對(duì)菌種產(chǎn)環(huán)麥芽糊精聚糖轉(zhuǎn)移酶活性的影響Fig.3 Effect of metallic ion on CGTase activity produced by the given bacteria

由圖3可知:添加 Cu2+時(shí)酶活最高，達(dá)1 083 U/mL，添加Mn2+和Co2+也可獲得較高酶活，添加K+時(shí)酶活僅為398 U/mL.若培養(yǎng)基中不添加金屬離子，則酶活更低，為267 U/mL.故在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中均添加Cu2+.

2.1.4 pH值對(duì)菌種產(chǎn)酶活性的影響

培養(yǎng)基pH在6～13變化時(shí)的酶活結(jié)果繪于圖4.結(jié)果顯示:酶活隨pH升高而增大，當(dāng)pH值為10時(shí)酶活最高，隨后降低.故在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中pH均調(diào)整為10.

圖4 pH對(duì)菌種產(chǎn)環(huán)麥芽糊精聚糖轉(zhuǎn)移酶活性的影響Fig.4 Effect of pH on CGTase activity produced by the given bacteria

2.1.5 培養(yǎng)溫度對(duì)菌種產(chǎn)酶活性的影響

培養(yǎng)溫度在20～45℃范圍內(nèi)變化時(shí)的酶活結(jié)果繪于圖5.結(jié)果顯示:酶活隨溫度升高而增大，當(dāng)溫度為35℃時(shí)酶活最高，隨后降低.故在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中培養(yǎng)溫度均為35℃.

圖5 溫度對(duì)菌種產(chǎn)環(huán)麥芽糊精聚糖轉(zhuǎn)移酶活性的影響Fig.5 Effect of temperature on CGTase activity produced by the given bacteria

2.1.6 接種量對(duì)菌種產(chǎn)酶活性的影響

由圖6可知:接種量對(duì)酶活的影響較大，當(dāng)接種量為10%時(shí)，酶活最高.故后續(xù)實(shí)驗(yàn)的接種量均為10%.

圖6 接種量對(duì)菌種產(chǎn)環(huán)麥芽糊精聚糖轉(zhuǎn)移酶活性的影響Fig.6 Effect of inoculation amount of bacteria on CGTase activity

2.1.7 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌種產(chǎn)酶活性的影響

在6～96 h內(nèi)連續(xù)測(cè)定酶活，結(jié)果繪于圖7.結(jié)果顯示:隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，酶活逐漸增大，72 h時(shí)酶活最高，達(dá)1 080 U/mL，隨后逐漸降低.故在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中菌種的培養(yǎng)時(shí)間均為72 h.

圖7 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌種產(chǎn)環(huán)麥芽糊精聚糖轉(zhuǎn)移酶活性的影響Fig.7 Effect of cultural time on CGTase activity produced by the given bacteria

采用上述最佳產(chǎn)酶條件，即麥芽糖為碳源，蛋白胨作為氮源，金屬離子為Cu2+，pH值為10，培養(yǎng)溫度為35℃，接種量為10%，培養(yǎng)微生物，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn).最高酶活可達(dá)1 130 U/mL.

2.2 AA-2G的合成條件優(yōu)化

采用2.1的最佳產(chǎn)酶條件培養(yǎng)菌種，獲得粗酶液，對(duì)生物轉(zhuǎn)化法合成AA-2G進(jìn)行研究.

AA-2G含量的測(cè)定采用標(biāo)準(zhǔn)加入法.以AA-2G質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，700 nm波長(zhǎng)處的吸光度(OD值)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其為不經(jīng)過原點(diǎn)的直線，如圖8所示.

圖8 AA-2G含量標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.8 The standard curve of AA-2G content

2.2.1 糖基供體種類對(duì)AA-2G合成的影響

由表1可知:β-環(huán)糊精作為糖基供體時(shí)，AA-2G的產(chǎn)量最高，為3.68 g/L，其次為麥芽糖，羧甲基纖維素鈉的產(chǎn)量最低.在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中均以β-環(huán)糊精為糖基供體.

表1 糖基供體對(duì)AA-2G合成的影響Table 1 Effect of donors of glycosyl on AA-2G synthesis

2.2.2 VC質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)AA-2G合成的影響

以不同VC質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行反應(yīng)，當(dāng)其為22%時(shí)，AA-2G的含量最高，為6.76 g/L，18%時(shí)產(chǎn)量也較高，而10%以下時(shí)，AA-2G產(chǎn)量均較低(見表2).在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中VC質(zhì)量分?jǐn)?shù)均采用22%.

表2 VC質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)AA-2G合成的影響Table 2 Effect of concentration of VC on AA-2G synthesis

2.2.3 反應(yīng)溫度對(duì)AA-2G合成的影響

合成AA-2G時(shí)的反應(yīng)溫度以20℃最為適宜，產(chǎn)量可高達(dá)7.93 g/L，25℃和30℃時(shí)稍有降低，當(dāng)反應(yīng)溫度達(dá)40℃及以上時(shí)，產(chǎn)量急劇降低(見表3).這是由于在微生物培養(yǎng)中，酶活最高時(shí)的溫度為35℃，高溫可能引起酶活下降，從而導(dǎo)致AA-2G的合成減緩.在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中反應(yīng)溫度均為20℃.

表3 反應(yīng)溫度對(duì)AA-2G合成的影響Table 3 Effect of reaction temperature on AA-2G synthesis

2.2.4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)AA-2G合成的影響

表4顯示:反應(yīng)時(shí)間為30 h時(shí)，AA-2G的含量最高，為7.23 g/L，再延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，產(chǎn)量不僅沒有提高，反而明顯降低.研究表明:環(huán)麥芽糊精聚糖轉(zhuǎn)移酶具有催化AA-2G生物合成的作用，也有催化逆反應(yīng)即AA-2G分解的雙向作用［8］，故反應(yīng)時(shí)間過長(zhǎng)，存在AA-2G逆反應(yīng)發(fā)生的現(xiàn)象，引起產(chǎn)量降低.

表4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)AA-2G合成的影響Table 4 Effect of reaction time on AA-2G synthesis

2.2.5 VC與糖基供體質(zhì)量比對(duì)AA-2G合成的影響

當(dāng)VC的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為22%時(shí)，VC與β-環(huán)糊精的質(zhì)量比為1∶1.5時(shí)，AA-2G的含量最高，為8.60 g/L(表5).

表5 VC與β-環(huán)糊精質(zhì)量比對(duì)AA-2G合成的影響Table 5 Effect of ratio of VC and β-cyclodextrin on AA-2G synthesis

3 結(jié)論與討論

(1)供試菌種產(chǎn)環(huán)麥芽糊精聚糖轉(zhuǎn)移酶的最佳條件為:麥芽糖為碳源，蛋白胨作為氮源，金屬離子為Cu2+，pH值為10，培養(yǎng)溫度為35℃，接種量為10%，酶活性可達(dá)1 130 U/mL.該酶活值較之其它研究偏低，可能是測(cè)定方法不同所致，在合成反應(yīng)中證明該酶活能滿足生產(chǎn)需求.

(2)生物法合成AA-2G的最佳反應(yīng)條件為:反應(yīng)溫度20℃，VC質(zhì)量分?jǐn)?shù)為22%，β-環(huán)糊精作為糖基供體且其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為33%，反應(yīng)時(shí)間為30 h，AA-2G的產(chǎn)量可高達(dá)8.60 g/L.據(jù)曹新志(2008)的研究，獲得AA-2G的產(chǎn)量為95.36 mg/L［8］，而王鵬等(2008)為 410 mg/L［9］，黃敏等(2006)為 104.21 mg/L［10］，與本文測(cè)得的產(chǎn)量差異較大，這里不排除測(cè)定方法差異、生物異質(zhì)性等因素所致，但更主要的是菌種的差異，還有轉(zhuǎn)化方法的不同，如實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，將傳統(tǒng)的水浴鍋改進(jìn)為搖床中反應(yīng)，使生產(chǎn)率大大提高，并使高濃度底物的投加成為可能.本文中的AA-2G產(chǎn)率具有非常大的應(yīng)用價(jià)值，值得在此基礎(chǔ)上繼續(xù)研究.

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