宋紅波，陳 軍，王 棟，方 琳，余文婕，儲 芳

(江蘇省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院溧陽檢測中心，溧陽市農(nóng)畜水產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心，江蘇 溧陽 213300)

膠體金免疫層析法和氣相色譜法測定動(dòng)物產(chǎn)品中氯霉素殘留

宋紅波，陳 軍，王 棟，方 琳，余文婕，儲 芳

(江蘇省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院溧陽檢測中心，溧陽市農(nóng)畜水產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心，江蘇 溧陽 213300)

對動(dòng)物產(chǎn)品中氯霉素殘留檢測的膠體金免疫層析法和氣相色譜法進(jìn)行比較研究。向樣品中分別添加0.3、0.5、1.5μg/kg三個(gè)添加水平的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品，用兩種方法進(jìn)行檢測。膠體金免疫層析法對0.5μg/kg以上均能檢出，氣相色譜法平均回收率分別為78.1%、85.3%和88.3%，變異系數(shù)為5.3%～9.0%，最低檢測限為0.3μg/kg。對108個(gè)樣品用膠體金免疫層析法篩選出3個(gè)陽性樣品，經(jīng)氣相色譜法驗(yàn)證皆為陽性，105個(gè)陰性樣品經(jīng)氣相色譜法檢測皆為陰性，未發(fā)現(xiàn)假陽性和假陰性。結(jié)果表明：膠體金免疫層析法具有快速，簡便，特異，靈敏度高的特點(diǎn)，適合基層檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)對動(dòng)物產(chǎn)品中氯霉素殘留現(xiàn)場快速篩選；氣相色譜法靈敏度高，適用于陽性樣品的精確定量。

動(dòng)物產(chǎn)品；氯霉素；膠體金免疫層析法；氣相色譜法

氯霉素是一類廣譜抗生素，對革蘭氏陰性菌和陽性菌均有很好的抑制作用，由于其優(yōu)良的抗菌性、穩(wěn)定的藥性和低廉的價(jià)格，曾作為細(xì)菌性疾病的治療藥物廣泛應(yīng)用于人和動(dòng)物臨床[1]。然而研究發(fā)現(xiàn)氯霉素對人體的造血系統(tǒng)毒害極大，同時(shí)具有肝臟毒性[2]。許多國家已禁止氯霉素在動(dòng)物生產(chǎn)中使用，聯(lián)合國糧農(nóng)組織也建議在畜牧業(yè)生產(chǎn)中停止使用氯霉素[3]，歐盟規(guī)定進(jìn)口水產(chǎn)品中氯霉素不得檢出[4]。因此，探討快速、便捷的氯霉素殘留檢測方法也引起了世界各國的廣泛關(guān)注。

目前氯霉素殘留分析方法很多[5-6]，主要有酶聯(lián)免疫法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)[7-9]、氣相色譜法(gas chromatography，GC)[10]、高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)[11-12]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(gas chromatography-mass spectrometer， GC-MS)[13-14]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(liquid chromatography-tandem mass spectrometer，LC-MS-MS)[15]，膠體金免疫層析法(gold immunochromatographic assay，GICA)[16]亦可見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)對膠體金免疫層析法和氣相色譜法測定動(dòng)物產(chǎn)品中氯霉素殘留的方法進(jìn)行比較研究，并對方法的回收率、精密度及檢測限進(jìn)行評價(jià)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 樣品及制備

實(shí)驗(yàn)樣品為凍雞肉、凍魚肉、凍蝦仁，均購自市場。其中雞肉50份，魚肉30份，蝦仁28份。將樣品去皮、去骨后取肌肉，制成均質(zhì)物，儲存于－18℃?zhèn)淝疤幚碛谩?/p>

1.1.2 試劑

氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品(純度99.5%) 德國Dr Ehrenstorfer公司；氯霉素膠體金免疫層析法試劑盒(包括反應(yīng)孔48個(gè)、氯霉素指示劑1瓶、檢測試紙片48片、10倍濃縮稀釋緩沖液) 大連普瑞康生物技術(shù)有限公司；C18固相萃取柱(填料量500mg，3mL)；乙酸乙酯、乙腈、正己烷(均為農(nóng)殘級) 美國Tedia公司；4g/100mL氯化鈉溶液；BSTFA＋TMCS (99:1)衍生化試劑 美國Supelco公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備

6890N型氣相色譜儀(配ECD檢測器) 美國安捷倫公司；JA-5002電子天平 上海精天電子儀器廠；AllegraTM21R臺式高速冷凍離心機(jī).. 美國Beckman公司；R-205旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國Bu chi公司；漩渦混合器、NEVAP-11155氮吹儀、固相萃取SPE裝置、微量移液槍。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理

GICA法：稱取樣品3g(精確到0.01g)，用6mL乙酸乙酯提取，3000r/min離心后吸取乙酸乙酯2mL置于10mL刻度離心管，氮?dú)饬鞔蹈?；先?mL正己烷溶解殘?jiān)?，再加?mL稀釋緩沖液，漩渦混合10s，3000r/ min離心10min，棄去上層正己烷層，下層水相備用。

GC法：稱取樣品5g(精確到0.01g)，用乙酸乙酯30mL分2次提取，速度離心4000r/min，將提取液乙酸乙酯層合并轉(zhuǎn)移到100mL細(xì)口雞心瓶中，于溫度40℃水浴中，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。向雞心瓶中加15mL、4g/ 100mL氯化鈉溶液，再用20mL正己烷分兩次脫脂，除去上層正己烷相，水相保留備用。給每個(gè)樣品準(zhǔn)備一根C18柱，依次用5mL甲醇和5mL水活化，將上一步脫脂得到的水相溶液注入C18柱，棄去流出液，用3mL水洗滌并抽干小柱，再用4mL乙腈將C18小柱中的氯霉素洗脫至5mL具塞離心管中，用氮?dú)獯蹈?。?00μL衍生化試劑，蓋塞并旋渦混合10s，在60℃烘箱中反應(yīng)30min。用氮?dú)饬鞔党嘤嗟脑噭翗悠饭軇偤么蹈蔀橹?。加?mL正已烷定容，供GC(ECD)檢測。

1.2.2 GICA法分析步驟

用微量移液器吸取70μL水相溶液加入反應(yīng)孔中，然后以試劑盒自帶小吸管加入氯霉素指示劑1滴(使用前充分搖勻)，充分振蕩混合5min。于待測反應(yīng)孔中放入試紙片(白色端在下)，跑片10min后按按照試劑盒說明判定結(jié)果，判定時(shí)間不宜超過20min。

1.2.3 GC法測試條件

色譜柱：填料35%聚二苯基二甲基硅氧烷(DB-35)毛細(xì)管柱，規(guī)格長：30m，內(nèi)徑0.25mm或0.32mm，膜厚0.25μm；載氣：氮?dú)猓涣髁浚?.2mL/min；尾吹氣流量：60mL/min；進(jìn)樣口溫度：260℃；柱溫：采用程序升溫：初溫80℃，維持1min；30℃/min升至200℃，維持0min；然后6℃/min升至250℃，維持5min；最后設(shè)定30℃/min升至270℃，維持5min以確保所有的化合物已經(jīng)流出；檢測器溫度：300℃；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣，分流吹掃時(shí)間0.75min；進(jìn)樣量：1μL。

1.2.4 GC法精密度和準(zhǔn)確度

方法準(zhǔn)確度以回收率表示，而精密度以變異系數(shù)來表示。向空白樣品中分別添加0.3、0.5、1.5μg/kg三個(gè)水平的氯霉素標(biāo)樣，每個(gè)添加量至少做3個(gè)平行，同時(shí)做3個(gè)空白樣。按1.2.1節(jié)方法進(jìn)行前處理，氣相色譜法檢測定量，計(jì)算回收率及各添加水平的變異系數(shù)。

1.2.5 GICA方法驗(yàn)證

稱取樣品5g(精確到0.01g)，向樣品中分別添加10μg/L氯霉素標(biāo)樣150、250、750μL，即添加水平為0.3、0.5、1.5μg/kg三個(gè)水平，每個(gè)水平設(shè)16個(gè)平行，同時(shí)做8個(gè)空白樣，按1.2.1節(jié)前處理和1.2.2節(jié)測定。

用膠體金免疫層析法對108個(gè)禽、水產(chǎn)品進(jìn)行篩選，陽性樣品用氣相色譜法驗(yàn)證，陰性樣品同時(shí)用氣相色譜法測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖1 氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.1 Chromatogram of chloramphenicol standard

氯霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線：以1、10、20、50、100μg/L氯霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液衍生后進(jìn)樣，測定其峰面積值，以峰面積對質(zhì)量濃度做工作曲線。結(jié)果表明氯霉素保留時(shí)間為15.41min，在1～100μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良好線形關(guān)系，回歸方程為Y＝4×106x＋2×107，r2＝0.997。氣相色譜儀檢測氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖見圖1。

2.2 GC法精密度和準(zhǔn)確度

實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確度以回收率表示，精密度以變異系數(shù)來表示，加標(biāo)量為0.3、0.5、1.5μg/kg，精密度和準(zhǔn)確度見表1。

表1 GC法測定的準(zhǔn)確度和精密度測定結(jié)果Table 1 Accuracy and precision of GC

從表1可看出，向樣品中添加0.3、0.5、1.5μg/kg三個(gè)水平的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)，平均回收率分別為78.1%、85.3%和88.3%，變異系數(shù)為5.3%～9.0%，方法重復(fù)性較好。

2.3 GICA法檢測結(jié)果

GICA法的原理是將特異性抗體先固定于硝酸纖維素膜的某一區(qū)帶，當(dāng)該硝酸纖維素膜一端浸入樣品時(shí)，由于毛細(xì)管作用，樣品沿著膜向前移動(dòng)，當(dāng)移動(dòng)至固定有抗體的區(qū)域時(shí)，樣品中相應(yīng)的抗原即與該抗體特異性結(jié)合，使免疫膠體金染色的該區(qū)域顯示一定的顏色，從而實(shí)現(xiàn)特異性免疫診斷。

向空白樣品中分別添加0.3、0.5、1.5μg/kg三個(gè)水平的氯霉素標(biāo)樣，每個(gè)水平設(shè)16個(gè)平行，同時(shí)做8個(gè)空白樣，按1.2.1前處理和1.2.2節(jié)測定，結(jié)果見表2。

表2 GICA法樣品檢測結(jié)果Table 2 Results of sample detection by GICA

從表2可知，8個(gè)空白樣品檢測結(jié)果為陰性；16個(gè)添加0.3μg/kg氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品的樣品，經(jīng)檢測有2個(gè)樣品為陽性，14個(gè)樣品為陰性；添加0.5、1.5μg/kg氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品的樣品，檢測結(jié)果為陽性，檢出率為100%。

2.4 檢測限

膠體金免疫層析法試劑盒檢測限：取試劑空白、0.30、0.60μg/L的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品各8份，按1.2.2節(jié)測定，結(jié)果見表3。

表3 GICA法標(biāo)準(zhǔn)品檢測結(jié)果Table 3 Results of standard CPA detection by GICA

由表3可知，膠體金免疫層析法對0.3μg/L及以上質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)品均能檢出，試劑盒檢測限為0.3μg/L。

樣品檢測限：從表2看出，向16個(gè)樣品中添加0.5μg/kg水平的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品均能檢出，初步確定該法檢測限至少為0.5μg/kg。根據(jù)《農(nóng)業(yè)部公告781-1－2006動(dòng)物源食品中氯霉素殘留量的測定：氣相色譜-質(zhì)譜法》(確證方法)中定量限為0.5μg/kg，GICA法的檢測限能滿足篩選要求。

氣相色譜法最低檢測限按照信噪比RSN＝3計(jì)算，得該方法檢測限為0.3μg/kg。

2.5 GICA法和GC法檢測實(shí)際樣品結(jié)果比較

用膠體金免疫層析法對108個(gè)禽、水產(chǎn)品進(jìn)行檢測，篩選出3個(gè)陽性樣品(按檢測限0.5μg/kg判定)，用氣相色譜法驗(yàn)證亦為陽性；其余105個(gè)樣品用膠體金免疫層析法篩選為陰性，經(jīng)氣相色譜法檢測均為陰性(檢測限0.3μg/kg)，結(jié)果見表4。

表4 GICA法和GC法檢測結(jié)果比較Table 4 Comparison of determination results of chloramphenicol residues in 108 samples by GICA and GC

由表4可見，GICA法篩選出的3個(gè)陽性樣品經(jīng)GC檢測結(jié)果均在0.5μg/kg以上，而陰性樣品均低于0.3μg/kg，顯示兩種檢測方法結(jié)果的吻合度較高。其中陽性雞肉樣品氯霉素濃度在檢測限附近，用GICA法亦能明顯判為陽性。表4的結(jié)果表明GICA法篩選假陽性率和假陰性率都為0，適用于動(dòng)物產(chǎn)品中氯霉素殘留篩選。

3 討 論

目前對動(dòng)物產(chǎn)品中氯霉素殘留的主要方法為氣相色譜法、氣質(zhì)聯(lián)用法、液質(zhì)聯(lián)用法、液相色譜法、酶聯(lián)免疫法，而膠體金免疫層析法的運(yùn)用才剛剛起步。氣相色譜法、氣質(zhì)聯(lián)用法、液質(zhì)聯(lián)用法靈敏度高、準(zhǔn)確性好，但前處理繁瑣，檢測成本高，且需要昂貴的儀器；液相色譜法檢測限過高，達(dá)不到出口產(chǎn)品殘留限要求，目前使用不多；酶聯(lián)免疫法是目前廣泛使用的氯霉素殘留篩選方法之一，其精密度與準(zhǔn)確度都很高，但陽性結(jié)果仍需經(jīng)氣相色譜法、氣質(zhì)聯(lián)用法確證。

用膠體金免疫層析法對動(dòng)物產(chǎn)品中氯霉素殘留進(jìn)行篩選，能在幾小時(shí)內(nèi)檢測幾十到上百個(gè)樣品，且不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備，樣品預(yù)處理簡單，檢測成本低，作為一種快速篩選手段，能大大提高檢測效率，在現(xiàn)場監(jiān)控和基層檢測中有著廣闊的推廣應(yīng)用前景。但目前篩選法的檢測標(biāo)準(zhǔn)極少，檢測限(即陽性濃度標(biāo)準(zhǔn))不統(tǒng)一，給檢測結(jié)果判定帶來一定困難，對篩選可疑結(jié)果需用色譜方法進(jìn)行確證。

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Comparative Applications of Colloidal Gold Immunochromatographic Assay and Gas Chromatography for the Determination of Chloramphenicol Residues in Food Products of Animal Origin

SONG Hong-bo，CHEN Jun，WANG Dong，F(xiàn)ANG Lin，YU Wen-jie，CHU Fang

(Liyang Testing Center, Institute of Supervision and Inspection Product Quality of Jiangsu Province, Liyang Agricultural, Domestic and Aquatic Products Quality Supervision and Testing Center, Liyang 213300, China)

Colloidal gold immunochromatographic assay (GICA) and gas chromatography (GC) was separately used for the analysis of chloramphenicol (CAP) residues in creatural products. Samples were spiked with 0.3, 0.5μg/kg and 1.5μg/kg CAP and determined by the methods. CAP residues at concentrations above 0.5μg/kg could be detected by GICA. The average recovery rates of GC were 78.1%, 85.3% and 88.3%, respectively with relative standard deviation (RSD) of 5.3%－9.0% and the detection limit was 0.3μg/kg. Three positive samples and other 105 samples analyzed by GICA were confirmed by GC and no false positive and negative samples were observed. Therefore, GICA is a rapid, accurate, reproducible and suitable to be used for rapid in situ screening of CAP residues in food products of animal origin, while GC is sensitive and suitable to be used for quantification of positive samples.

food products of animal origin；chloramphenicol；GICA；GC

TS207.3

A

1002-6630(2012)08-0229-04

2011-04-05

宋紅波(1980—)，女，助理研究員，碩士，主要從事食品安全檢測技術(shù)研究。E-mail：lichenlsong@yahoo.com.cn