紀淑娟，于蘭潔，劉 玲，白 冰，周 丹

(沈陽農(nóng)業(yè)大學食品學院，遼寧 沈陽 110866)

響應曲面法優(yōu)化仲丁胺氣相色譜檢測的衍生條件

紀淑娟，于蘭潔，劉 玲，白 冰，周 丹

(沈陽農(nóng)業(yè)大學食品學院，遼寧 沈陽 110866)

利用響應面法優(yōu)化仲丁胺氣相色譜檢測的衍生條件。根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗設計原理，針對試驗中衍生化反應這一重要環(huán)節(jié)，在單因素試驗基礎上，以仲丁胺回收率為響應值，應用響應曲面法研究衍生反應時間、溫度、衍生劑用量各因素間的交互作用及其對仲丁胺測定回收率的影響。以五氟苯甲醛溶液作為衍生劑，經(jīng)氣相色譜電子捕獲檢測器分析測定。確定最佳衍生條件為：衍生反應時間31.72min、衍生反應溫度22.42℃、衍生劑用量1.25mL。

仲丁胺；殘留；衍生；響應曲面法；氣相色譜

仲丁胺(sec-butylamine，2-AB)，分子式為CH3CH (NH2)C2H5，是具有對映異構現(xiàn)象的簡單二級胺，有刺激性氨臭味，呈無色液體狀，有較強的揮發(fā)性。可以任意比例與水混溶并可溶于多種有機溶劑[1-3]。仲丁胺具有一定的毒性，人們食用含有仲丁胺的食品后，可隨尿液排出一部分，另一部分積累在腎臟中。動物試驗表明，白鼠(rat)的半致死劑量(LD50)為380mg/kg，美國將其歸為三級危險品。美國食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)規(guī)定仲丁胺的每日允許攝入量(acceptable daily intake，ADI)為0～0.1mg/kg[4]。

仲丁胺可以有效地抑制根霉、青霉和綠霉等真菌的生長和繁殖，我國允許其在一定范圍內用作果蔬防腐保鮮劑，目前，主要應用于柑橘、檸檬、蘋果、蒜薹、青椒等果品蔬菜的貯運保鮮。GB 2760—2011《食品添加劑使用衛(wèi)生標準：蒜薹、青椒、柑橘、葡萄中仲丁胺殘留量測定》規(guī)定仲丁胺殘留的限量標準為：柑橘果肉0.005mg/kg、荔枝果肉0.009mg/kg、蘋果果肉0.001mg/kg；新鮮蔬菜(蒜薹和青椒)3mg/kg。目前，我國檢測仲丁胺殘留的標準方法為NY/T 946—2006《蒜薹、青椒、柑橘、葡萄中仲丁胺殘留量測定》，該方法采用薄層色譜法，檢出限較高。本實驗采用仲丁胺衍生化后氣相色譜法測定的技術路線，重點對衍生反應條件進行優(yōu)化篩選，以期為建立可靠、穩(wěn)定、靈敏的仲丁胺殘留量檢測方法奠定基礎[5-8]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

正己烷(色譜純)、乙腈(色譜純) 杭州阿拉丁公司；仲丁胺(純度≥99.5℅) 四川西亞試劑；五氟苯甲醛(≥98%) 美國Acros公司；氫氧化鈉(分析純) 中國國藥集團；無水硫酸鈉(分析純) 沈陽化學試劑廠；聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP 分析純) 德國Sigma公司；DB1701毛細管柱 美國Agilent公司。

1.2 儀器與設備

CP3800氣相色譜儀 美國Varian公司；渦旋震蕩儀 德國IKA公司；HY-2調速多用振蕩器 常州國華電器有限公司；KQ5200超聲波清洗儀 昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 衍生

衍生劑的配制：準確稱取0.5μL五氟苯甲醛(PFB)，用乙腈定容至10mL，體積分數(shù)0.05μL/mL。

在10mL仲丁胺標準溶液中加入1mL 0.1mol/L氫氧化鈉溶液，使體系處于pH12的堿性環(huán)境，搖勻后加入衍生劑溶液，在一定溫度下恒溫反應一定時間后，用2mL正己烷分兩次振蕩提取衍生產(chǎn)物五氟芐亞胺，收集提取液，加入1mL 0.1mol/L氫氧化鈉，洗滌未反應完全的衍生劑，收集正己烷，用無水硫酸鈉脫水，供氣相色譜儀測定[9-11]。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：DB1701毛細管柱(30m×320μm，0.25μm)，不分流進樣，載氣為高純度氮氣(99.999%)，升溫程序：以80℃為初始溫度，保持5min，以3℃/min升溫至130℃，再以20℃/min，升溫至250℃，保持10min，全程33.52min，進樣口溫度：250℃，檢測器溫度：350℃，流速1.5mL/min，進樣量1.0μL，外標法定量[11-16]。

1.3.3 標準曲線的繪制

0.1mg/kg仲丁胺標準儲備溶液：準確量取仲丁胺標準品1.39μL，用蒸餾水定容至10.0mL，準確移取其中1.0mL，蒸餾水定容至10.0mL，依次10倍比例稀釋，最終得到0.1mg/kg仲丁胺標準儲備液。

分別移取0.1mg/kg仲丁胺標準儲備液1、2、3、4、5、6mL于10.0mL容量瓶中，用蒸餾水定容，得到含量分別為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06mg/kg的仲丁胺標準工作液，衍生后測定，繪制標準曲線。

1.3.4 試驗設計與分析方法

應用Minitab 15 中文軟件對試驗數(shù)據(jù)進行分析[17-20]。

2 結果與分析

2.1 仲丁胺標準曲線

不同質量濃度的仲丁胺標準溶液經(jīng)氣相色譜測定，得標準曲線如圖1所示，線性回歸方程為：y＝1297.3x＋48.503，R2＝0.9966(x為質量濃度(mg/mL)，y為峰面積)。當仲丁胺質量濃度在0～0.06mg/mL時，其質量濃度與峰面積呈良好的線性關系。

圖1 仲丁胺標準曲線Fig.1 Standard curve of sec-butylamine

2.2 單因素試驗

2.2.1 衍生反應溫度的篩選

在衍生時間30min、衍生劑用量1mL條件下考察衍生溫度對衍生反應效果的影響，結果見圖2。

圖2 衍生反應溫度對回收率的影響Fig.2 Effect of reaction temperature on recovery rate of sec-butylamine

由圖2可知，衍生反應溫度在20～30℃范圍內，仲丁胺的回收率比較平穩(wěn)，且均高于85%，當溫度超過30℃時，回收率呈急劇下降趨勢。因此，初步確定衍生反應的適宜溫度20～30℃。

2.2.2 衍生反應時間的篩選

在反應溫度25℃、衍生劑用量1mL條件下考察衍生時間對回收率的影響，結果見圖3。

由圖3可見，當衍生反應時間為20～50min時，仲丁胺的回收率均可達到80%以上；當衍生時間超過50min時，仲丁胺的回收率隨反應時間的延長而大幅下降。這可能是由于時間過長，衍生反應產(chǎn)物部分分解損失的緣故。因此，初步確定反應時間在20～50min較為適宜。

圖3 衍生反應時間對回收率的影響Fig.3 Effect of reaction time on recovery rate sec-butylamine

2.2.3 衍生劑用量的確定

在反應溫度25℃、反應時間30min條件下，考察衍生劑用量對回收率的影響，結果見圖4。

圖4 衍生劑用量對回收率的影響Fig.4 Effect of derivatization reagent on recovery rate of sec-butylamine

圖4表明，衍生劑用量對檢測效果影響較大，隨著衍生劑用量的增加，回收率呈逐漸遞增的趨勢，其中，衍生劑用量為0.5mL時，回收率低于70%，衍生劑用量為0.75～1.25mL時，仲丁胺的回收率在80%～120%之間，而當衍生劑用量超過1.25mL時，回收率大于120%，可能是由于過量的衍生劑本身對測定產(chǎn)生干擾的緣故。因此，初步確定適宜的衍生劑用量為0.75～1.25mL。

2.3 響應曲面法優(yōu)化衍生反應條件

2.3.1 仲丁胺衍生反應條件的試驗設計

在單因素試驗基礎上，根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗設計原理，對反應時間、反應溫度、衍生劑用量三個衍生反應關鍵因素進一步進行優(yōu)化。試驗中，采用三因素三水平響應面分析法，重復3次，以隨機次序進行的15個試驗點可以分為兩類，第1類是12個析因點，自變量取值在X1、X2、X3所構成的三維頂點；第2類是3個零點，為區(qū)域的中心點，用以估計試驗誤差。因素與水平設計見表1，響應面分析方案及試驗結果見表2。

表1 響應面試驗因素水平表Table 1 Factors and levels for response surface analysis

表2 仲丁胺衍生反應響應面試驗設計及結果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

將表2中不同條件下所測得的仲丁胺回收率，應用Design Expert 7.1統(tǒng)計軟件進行回歸擬合，根據(jù)表3中顯示的方程中各項P值的顯著性，去掉P值不顯著項，得到仲丁胺回收率的回歸方程：Y＝99.4－0.975X2＋31.925X3－1.25X1X2－4.35X1X3－11X12－8.65X22。

2.3.2 模型方差分析

利用Design Expert 7.1 統(tǒng)計軟件進行二次多元回歸擬合，得到回歸方程模型的方差分析和回歸方程系數(shù)估計值，如表3所示。

由表3可知，3個因素的P值相差較大，對回收率結果的影響順序為：衍生劑用量(X3)＞衍生溫度(X2)＞衍生時間(X1)，其中衍生劑用量和衍生溫度的一次項回歸系數(shù)達到極顯著水平；衍生溫度(X2)和衍生時間(X1)的二次項回歸系數(shù)達到極顯著水平；衍生時間(X1)與衍生溫度(X2)、衍生時間(X1)與衍生劑用量(X3)的二次項回歸系數(shù)達到極顯著水平，說明他們之間存在明顯交互作用。

表3 二次回歸方程系數(shù)顯著性檢驗Table 3 Significance test of regression equation coefficients in the fitted regression model

表4 中心組合設計二次模型方差分析Table 4 Variance analysis for the fitted regression model

從表4可知，模型P＜0.01，達到極顯著，表明不同處理之間差異極顯著。模型失擬項P＝0.074＞0.05，模型失擬項不顯著，模型選擇合適。由此可見，各具體試驗因素對響應值的影響不是簡單的線性關系。相關系數(shù)R2＝99.42%＞0.8，說明回收率實際值與預測值之間具有較好的擬合度，表明該數(shù)學模型中3個因素對仲丁胺回收率的影響達0.9942%，而其他因素的影響和誤差占0.58%，即只有0.58%的變異不能由該模型解釋，因此該模型可用于預測響應值仲丁胺回收率的實際情況。2.4 雙因素交互作用分析

圖5 各因素交互作用對仲丁胺回收率影響的響應面圖與等高線圖Fig.5 Response surface and contour plots showing the pairwise interaction effects of derivatization conditions on recovery rate of sec-butylamine

為了分析任意兩因素交互作用的影響，固定三個因素中任意一個因素在零水平，研究另兩個因素的交互效應，其響應面與等高線圖見圖5。

如圖5A所示，在反應時間處于較低水平的情況下，隨著反應溫度的升高，回收率呈現(xiàn)從急劇升高到急劇降低的變化趨勢，而在衍生反應時間較長時，隨著反應溫度的升高，回收率呈現(xiàn)從急劇下降到急劇升高的趨勢。上述變化趨勢說明衍生反應時間與溫度之間存在著顯著的交互作用，不同的衍生反應時間與溫度的組合，會導致回收率發(fā)生較大變化。從圖1可以看出，衍生反應溫度相比反應時間，對回收率有更強的影響。

如圖5B所示，在衍生劑用量處于較低水平時，回收率呈現(xiàn)較低水平，但仍隨著反應時間的延長呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，而在衍生劑用量處于較高水平的情況下，回收率顯現(xiàn)較高水平，并隨著反應時間的延長顯現(xiàn)穩(wěn)步上升的趨勢，上述變化趨勢說明衍生反應時間與衍生劑用量之間存在顯著的交互作用，不同水平的衍生反應時間與衍生劑用量的組合，會導致不同的響應值變化。

如圖5C所示，在衍生反應溫度處于較低水平時，隨著衍生劑用量的增加回收率顯現(xiàn)急劇增加的趨勢，而在反應時間處于較高水平的情況下，隨著衍生劑用量的增加回收率仍顯現(xiàn)較大幅度的增加，上述變化趨勢說明衍生反應溫度與衍生劑用量之間不存在顯著的交互作用。

3 討 論

衍生反應條件直接關系到仲丁胺的檢測效果。本實驗通過響應面設計方法，考察了衍生反應溫度、時間以及衍生劑用量對仲丁胺衍生效果的影響，優(yōu)化了衍生反應條件。結果表明，多元二次回歸方程的模型回歸顯著，且失擬性檢驗不顯著，說明通過本試驗所建立的二次回歸方程成功地反映了所考察的三個因素與響應值之間的相關性。在仲丁胺衍生并測定過程中，衍生反應時間、溫度及衍生劑用量都是影響仲丁胺回收率的關鍵因素，三個因素的影響順序為：衍生劑用量＞衍生溫度＞衍生時間。并且反應時間與溫度、反應時間與衍生劑用量的交互作用對回收率的影響極為顯著。各因素的最佳條件為：衍生時間31.72min、衍生溫度22.42℃、衍生劑用量1.25mL，理論回收率為112%。以衍生時間31.7min、衍生溫度22.4℃、衍生劑用量1.25mL，進行衍生反應試驗得到平均回收率為(108±1.71)%，與軟件預測的回收率數(shù)值較為接近。

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Optimization of Derivatization Conditions for Gas Chromatographic Determination of Sec-Butylamine by Response Surface Methodology

JI Shu-juan，YU Lan-jie，LIU Ling，BAI Bing，ZHOU Dan

(College of Food, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China)

Derivatization reaction is very important for the determination of sec-butylamine. For the purpose of establishing a gas chromatography-electron capture detection (GC-ECD) method for determining sec-butylamine, the optimal derivatization reaction conditions were studied by response surface methodology. Based on the results of one-factor-at-a-time experiments, a central composite design was used to investigate the pairwise interaction effects of reaction time, temperature and derivatization reagent (acetonitrile containing 0.05μL/mL pentafluorobenzaldehyde) amount on sec-butylamine recovery. The optimal derivative temperature, derivative duration and derivatization reagent amount were found to be 22.42 ℃, 31.72 min and 1.25 mL, respectively.

sec-butylamine；residue；derivatization；response surface methodology；gas chromatography

TS207.3

A

1002-6630(2012)08-0211-05

2011-06-27

農(nóng)業(yè)部行業(yè)標準制定項目(2130109)

紀淑娟(1960—)，女，教授，博士，主要從事食品質量控制。E-mail：jsjsyau@sina.com