李玉玲，李衛(wèi)華*，楊秀清

(1.山西大學生物技術(shù)研究所，山西 太原 030006； 2.山西出入境檢驗檢疫局，山西 太原 030024)

反相高效液相色譜法檢測奶粉中含硫氨基酸

李玉玲1，李衛(wèi)華2,*，楊秀清1

(1.山西大學生物技術(shù)研究所，山西 太原 030006； 2.山西出入境檢驗檢疫局，山西 太原 030024)

目的：建立奶粉中含硫氨基酸反相高效液相色譜檢測方法，為含硫氨基酸檢測提供新思路。方法：用常規(guī)酸水解和氧化水解法水解奶粉，對水解條件和色譜分離和檢測條件進行研究，用反相高效液相色譜法測定奶粉中的含硫氨基酸。結(jié)果：蛋氨酸(Met)、胱氨酸[(Cys)2]檢出限分別為0.7、0.3μmol/L，定量檢測范圍均為10～300μmol/L，相關(guān)系數(shù)分別為0.9993、0.9992。經(jīng)酸水解和氧化水解處理的奶粉，所測得的Met含量無顯著差異，均為0.43g/100g，(Cys)2的含量則分別為0.06、0.14g/100g，差異顯著。結(jié)論：奶粉中Met含量的高效液相色譜HPLC檢測可選用酸水解或氧化水解中任一種前處理方法，(Cys)2含量的測定只能采用氧化法進行前處理。

奶粉；乳蛋白；含硫氨基酸；高效液相色譜法

奶粉是我國最主要的乳制品品種，產(chǎn)值約占乳制品工業(yè)總產(chǎn)值的三分之一[1]。奶粉中的乳蛋白包含人體生長發(fā)育所需要的全部必需氨基酸，是一種全價蛋白質(zhì)，也是人體補充熱量的來源[2]。乳蛋白中的含硫氨基酸(蛋氨酸、半胱氨酸/胱氨酸)對人和動物的生理功能具有重要的作用，其代謝反常往往是一些疾病的重要表征。因此，在臨床、營養(yǎng)、動物科學與農(nóng)業(yè)科學領(lǐng)域?qū)虬被岬臏蚀_測定有著重要的意義[3-4]。含硫氨基酸在游離或肽鍵合狀態(tài)都不穩(wěn)定，易于發(fā)生氧化、烷基化等反應而影響其檢測的準確性，國內(nèi)外學者在這方面進行了大量的研究。在使用離子交換色譜前處理方法時，提出補償校正法、化學保護法、氧化法、還原衍生法等解決方法，但大多存在一些問題[5]。常碧影[6-8]、錢愛萍[9]、徐潔[10]、楊元秀[11]等對檢測飼料中含硫氨基酸的前處理方法進行了研究；于淑新等[12]采用高效液相色譜法測定飼料中含硫氨基酸。本研究對苯酚保護巰基的酸水解法和過甲酸氧化含硫氨基酸生成磺基丙氨酸和蛋氨酸砜的氧化水解法兩種前處理方法進行比較。用新型衍生劑4-氯-3,5-二硝基三氟甲苯(4-chloro-3,5-dinitrobenzotrifluoride，CNBF)對奶粉的蛋白水解液進行柱前衍生，反相高效液相色譜方法進行氨基酸檢測。通過對兩種水解方法檢測結(jié)果的比較，確定蛋氨酸和(半)胱氨酸兩種含硫氨基酸的最佳檢測條件，從不同角度為奶粉中含硫氨基酸的檢測提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

奶粉 市售。

嬰兒奶粉標準品 美國Fapas公司；高純L-氨基酸(＞98%)：蛋氨酸(Met)、胱氨酸[(Cys)2]、半胱氨酸(Cys)、磺基丙氨酸(CysA)、蛋氨酸砜[Met(O2)] 北京日出生物科技有限公司；4-氯-3,5-二硝基三氟甲苯(CNBF) 太原市瑞和豐科貿(mào)有限公司；乙腈(色譜純)天津市科密歐化學試劑有限公司；濃鹽酸(優(yōu)級純) 天津市北聯(lián)精細化學品開發(fā)有限公司；超純水(由Milli-Q純水機制備)；25、100mmol/L 4-氯-3,5-二硝基三氟甲苯(CNBF)溶液；常規(guī)過甲酸溶液：30%過氧化氫與88%甲酸按1:9(V/V)混合，室溫放置1h，置冰水浴中冷卻30min，臨用前配制；40mmol/L氨基酸標準溶液；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Alliance2690高效液相色譜儀、ACQUITY超高效液相色譜儀(光電二極管矩陣檢測器，用于光譜掃描) 美國Waters公司；資生堂CAPCELL PAK C18柱 北京泰克美科技有限公司；DF-15L型氮吹儀供氮機 杭州德克爾實驗設(shè)備有限公司；101A-3型干燥箱 上海市實驗儀器總廠；Minispin離心機 德國Eppendorf公司；1008型恒溫水浴鍋 德國GFL公司； PB-10酸度計 德國Sartorious公司；G-560E Vortex-Genie2-渦旋振蕩器 美國Scientific Industries公司；0.22μm針筒過濾器 天津博納艾杰爾科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

酸水解法：準確稱取樣品適量，加入3.0mL 6mol/L HCl溶液(含0.1%苯酚)，－20℃冷凍，N2吹，在吹N2狀態(tài)下封口，110℃水解24h。水解結(jié)束后取出冷卻至室溫，開封，用pH9.0硼砂-硼酸緩沖液定容到10mL，混勻，靜置，離心。取上清液于40℃ N2吹干，用pH 9.0硼砂-硼酸緩沖液溶解，混勻，振蕩加入CNBF衍生。

氧化水解法：準確稱取樣品適量，冰水浴30min后加入2.0mL已冷卻的過甲酸溶液，封口，冰水浴氧化16h。氧化結(jié)束，開口，加入0.3mL 48%氫溴酸，輕輕搖勻，繼續(xù)冰水浴30min后取出，40℃ N2吹干。再加入6mol/L HCl溶液3.0mL，搖勻，N2吹干，封口，110℃水解24h。水解結(jié)束后取出，處理方法同酸水解法。

1.3.2 樣品衍生

準確吸取1.0mL樣品溶液于帶蓋試管中，振蕩并加入5.0mL pH9.0硼砂-硼酸緩沖液及2.0mL CNBF溶液，蓋好蓋子，封口，放入65℃水浴40min。衍生結(jié)束后取出，放置至室溫，振蕩并加入17mL pH7.0磷酸緩沖液，振蕩0.5min，再靜置10min，取適量液體用0.22μm過濾器過濾至上機小瓶，待用。

1.3.3 反相高效液相色譜法檢測條件

流動相A：乙腈；流動相B：乙酸-乙酸鈉緩沖液pH6.8；檢測波長：240nm；流速：0.32mL/min；色譜柱：C18MGⅡ(5μm，4.6mm i.d.×250mm)；梯度洗脫：0～15min，20%A、80%B；15～35min，38%A、62%B；35～38min，48%A、52%B；38～42min，49%A、51%B；42～50min，75%A、25%B；50～55min，75%A、25%B；55～65min，20%A、80%B)。

1.3.4 前處理方法的優(yōu)化

準確稱取適量奶粉標準品(精確到0.0001g)，分別采用酸水解法、氧化水解法水解奶粉中的蛋白質(zhì)，通過不同量的奶粉標準品單因素試驗、安培瓶與水解管水解比較實驗、不同鹽酸及過甲酸用量氧化水解實驗、奶粉標準品及標準氨基酸精密度及回收率實驗，確定奶粉中含硫氨基酸的最佳前處理方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同標準氨基酸的色譜峰分離效果比較

圖1 CysA、Met(O2)標準氨基酸色譜圖Fig.1 Chromatogram showing the separation between CysA and Met(O2)

圖2 Met、(Cys)2標準氨基酸色譜圖Fig.2 Chromatogram showing the separation between Met and (Cys)2

奶粉中分解所得到的含硫氨基酸為(Cys)2和Met，在對奶粉進行常規(guī)酸水解時得到的是這兩種氨基酸；當用過甲酸處理后，巰基和二硫鍵被氧化成磺酸基，生成CysA；Met與過甲酸作用則生成Met(O2)。圖1顯示，當使用CysA和Met(O2)作為標準氨基酸檢測時，可獲得較好的分離效果。色譜峰的分離受溫度影響較小，18～26℃范圍內(nèi)都能夠較好分離；圖2顯示，當檢測Met和(Cys)2兩種標準氨基酸時，二者的色譜峰與衍生劑的水解產(chǎn)物的出峰時間較接近，不易分離，且對溫度條件要求比較嚴格(19～21℃)。采用氧化水解法處理奶粉時得到的是氨基酸的氧化產(chǎn)物CysA和Met(O2)，而采用常規(guī)酸水解法水解奶粉時得到的是Met和(Cys)2，在選擇水解方法時要考慮色譜峰的分離效果。

2.2 方法檢測限及線性范圍

準確吸取 Met、(Cys)2、CysA、Met(O2)氨基酸標準液適量，用pH9.0硼砂-硼酸緩沖液以倍比稀釋法分別配制300、200、100、60、30、10μmol/L六個不同濃度的混合標準溶液，上機檢測后，以氨基酸濃度為橫坐標，吸收峰面積為縱坐標做標準曲線，得到標準氨基酸的分離色譜圖(圖1、2)，其檢測限及線性范圍結(jié)果見表1。

表1 標準氨基酸的方法檢測限及線性范圍Table1 Detection limits and linear ranges of the developed method for standard amino acids

由表1可見，在信噪比RSN≥3的情況下，4種標準氨基酸的最低檢出限(limit of detection，LOD) 值小，Met和(Cys)2檢出限分別為0.7、0.3μmol/L檢測靈敏度高；RSN≥10時，最低定量限(limit of quantity，LOQ)低且在10～300μmol/L定量范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)R2≥0.9992，均線性良好，可作標準曲線用。

2.3 不同樣品量對蛋氨酸檢測結(jié)果的影響

將3份不同量的奶粉分別于安培瓶中按1.3.1節(jié)方法處理后進行測定，結(jié)果如圖3所示。可以看出，隨樣品量的增加，Met測定值逐漸增大，不同樣品量Met均有很好的回收率，樣品量為30mg時回收率最佳。

圖3 不同樣品量對Met檢測的影響Fig.3 Effect of sample amount on the determination of methionine

2.4 鹽酸及過甲酸用量對檢測結(jié)果的影響

采用不同量的鹽酸和過甲酸對奶粉進行水解，結(jié)果見表2。從A～E組，(Cys)2及Met含量逐漸升高，且E組(Cys)2及Met含量最高，說明30mg奶粉樣品在加入2mL過甲酸、0.3mL 48%氫溴酸、3mL 6mol/L HCl溶液的前處理條件為含硫氨基酸的理想檢測條件。

表2 鹽酸及過甲酸用量對含硫氨基酸檢測結(jié)果的影響Table 2 Effect of adding different amounts of hydrochloric acid and peroxyformic acid for sample pretreatment on the determination of sulfur-containing amino acids

2.5 奶粉標準品檢測

用已知Met、(Cys)2標準值范圍的奶粉標準品分別經(jīng)酸水解和氧化水解后，結(jié)果見表3。可以看出，經(jīng)酸水解和氧化水解后Met測定值均符合標準值范圍，說明兩種前處理方法對Met含量測定均沒有影響；經(jīng)氧化水解后，(Cys)2測定值在標準值范圍內(nèi)，但經(jīng)酸水解后其測定值則低于標準值范圍，說明奶粉經(jīng)酸水解后(Cys)2損失較大，不能得到準確的檢測結(jié)果。

表3 奶粉標準品含硫氨基酸的測定值Table 3 Determination results for sulfur-containing amino acids in standard milk powder pretreated by different methods

2.6 精密度及回收率實驗

圖4 奶粉樣品酸水解(A)及氧化水解(B)色譜圖Fig.4 Chromatogram of milk powder pretreated by different methods

由圖4A可見，Met、(Cys)2與(CNBF)OH有效分離；圖4B中Met、(Cys)2分別氧化成的Met(O2)、CysA與其他氨基酸完全分離，滿足檢測要求。圖4中未標色譜峰為奶粉中的其他氨基酸。

表4 奶粉樣品中氨基酸加標回收結(jié)果Table 4 Spiked recovery rates of sulfur-containing amino acids in standard milk powder

由表4可以看出：酸水解及氧化水解后Met含量均在85μmol/kg(0.43g/100g)左右，且RSD值小，加標回收率高，說明這兩種方法均可檢測奶粉樣品中Met含量，氧化水解方法精密度更好。酸水解后(Cys)2含量為7.8μmol/kg(0.06g/100g)，氧化水解后(Cys)2含量為17.8μmol/kg(0.14g/100g)，酸水解含量僅為氧化水解的一半，且RSD值高，加標回收率低，說明(Cys)2在酸水解過程中容易被破壞，用氧化水解法檢測精密度良好，加標回收率高。

3 結(jié) 論

本研究確立了奶粉中含硫氨基酸的反相高效液相色譜檢測方法，方法的最佳前處理條件為在30mg奶粉樣品中加入3.0mL 6mol/L HCl溶液(含0.1%苯酚)，使用安培瓶的酸水解；或30mg奶粉樣品中加入2.0mL過甲酸氧化，0.3mL 48%氫溴酸終止氧化反應，再加入3.0mL 6mol/L HCl溶液水解的氧化水解。奶粉樣品經(jīng)酸水解及氧化水解兩種方法處理后，可用反相高效液相色譜法法準確測定蛋氨酸含量，但采用氧化水解方法處理后蛋氨酸含量的精密度較好；胱氨酸在酸水解過程中損失較為嚴重，影響檢測的準確性，氧化水解前處理后用HPLC方法檢測能夠得到準確的結(jié)果。

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Determination of Sulfur-Containing Amino Acids in Milk Powder by Reverse-Phase High Performance Liquid Chromatography

LI Yu-ling1，LI Wei-hua2,*，YANG Xiu-qing1
(1. Bio-technology Institute, Shanxi University, Taiyuan 030006, China；
2. Shanxi Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Taiyuan 030024, China)

Objective: To establish a new method for the determination of sulfur-containing amino acids in milk powder by reverse-phase high performance liquid chromatography (HPLC). Methods: Milk powder was subjected to acid hydrolysis or oxidation and subsequent hydrolysis. The optimal hydrolysis conditions and chromatographic separation conditions were investigated. Results: The detection limits of the method for methionine and (Cys)2 were 0.7μmol/L and 0.3μmol/L, respectively,and the linear ranges were both 10－300μmol/L with correlation coefficients of 0.9993 and 0.9992, respectively. In addition,no significant difference was observed between the results of methionine content obtained with acid hydrolysis and oxidation and subsequent hydrolysis, which were both 0.43 g/100 g, whereas the (Cys)2 contents were 0.06 g/100 g and 0.15 g/100 g,respectively, showing a significant difference. Conclusion: Both acid hydrolysis and oxidation followed by hydrolysis can be used for the detection of methionine in milk powder, but only the latter is suitable for the detection of (Cys)2.

milk powder；lactoprotein；sulfur amino acids；high performance liquid chromatography

Q517

A

1002-6630(2012)08-0167-04

2011-08-26

國家質(zhì)檢總局科研項目(2010IK157)

李玉玲(1986—)，女，碩士研究生，研究方向為生物化學與分子生物學。E-mail：sxlclyl1986@163.com

*通信作者：李衛(wèi)華(1968—)，男，研究員，博士，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品安全。E-mail：aplab@163.com