劉振春，張利寬，于 暢，馮建國(guó)

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品與科學(xué)工程學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118)

響應(yīng)面優(yōu)化超聲波輔助提取發(fā)芽糙米黃酮工藝

劉振春，張利寬，于 暢，馮建國(guó)

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品與科學(xué)工程學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118)

以體積分?jǐn)?shù)50%的乙醇溶液為提取溶劑，采用超聲技術(shù)從發(fā)芽糙米中提取黃酮類化合物。采用Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)法建立影響因素的二次回歸模型。通過(guò)響應(yīng)面分析得到超聲波輔助提取發(fā)芽糙米黃酮的最佳提取條件為超聲時(shí)間11.7min、浸提溫度45.8℃、浸提時(shí)間30.5min、液料比18.9:1(mL/g)，發(fā)芽糙米黃酮的提取量可達(dá)(0.743±0.011)mg/g(n＝5)，達(dá)到理論值0.754mg/g的98.5%。該回歸模型模擬度良好，可以作為發(fā)芽糙米黃酮提取量測(cè)定的理論依據(jù)。

發(fā)芽糙米；黃酮；超聲波；響應(yīng)面

我國(guó)稻谷年產(chǎn)量約2億噸，占全國(guó)糧食總產(chǎn)量的2/5，占世界稻谷產(chǎn)量的1/3，世界上有近一半的人以稻谷為主食[1]。隨著對(duì)發(fā)芽糙米中主要活性成分[2]及生理功能[3]的研究發(fā)現(xiàn)糙米的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值是精米難以媲美的。因此糙米及其活性成分的研究具有極大的開(kāi)發(fā)潛力。

發(fā)芽糙米是指優(yōu)質(zhì)糙米在一定的溫度條件下浸泡之后控制其發(fā)芽，并使其發(fā)芽長(zhǎng)度保持在0.5～1mm的濕制品或干制品。糙米的發(fā)芽過(guò)程實(shí)質(zhì)[4]是糙米中所含有的大量酶被激活和釋放，并從結(jié)合態(tài)轉(zhuǎn)化為游離態(tài)的生化過(guò)程。正是由于這一生理過(guò)程，發(fā)芽后的糙米糠層纖維被軟化[5]，從而改善了糙米的蒸煮性、口感和消化性[6-7]；糙米發(fā)芽之后產(chǎn)生了很多功能性成分，如可溶性糖、多肽、GABA、阿魏酸、谷胱甘肽、角鯊烯、肌醇、肌醇六磷酸等[8-10]。與糙米相比，發(fā)芽糙米的生理活性[11-12]具有明顯的優(yōu)勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)采用Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)法對(duì)超聲波輔助提取發(fā)芽糙米提取黃酮工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期為發(fā)芽糙米中黃酮提取工藝提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

市購(gòu)糙米，經(jīng)發(fā)芽[13]干燥、微粉碎后備用。

無(wú)水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等均為分析純；蘆丁(標(biāo)品級(jí)) 天津一方科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FDV DUTPUT-2HP型原泰奇氣引式超微粉碎機(jī) 日本佑琦有限公司；JY99-2D超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；SHA-B水浴恒溫振蕩器 金壇市醫(yī)療器械廠；FA1004A電子天平 上海精天電子儀器有限公司；LXJ-ⅡB離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；UV mini-1240型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本島津公司.。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)芽糙米黃酮的超聲波輔助提取工藝流程

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程的建立[14]

精確稱取0.020g蘆丁標(biāo)品，用體積分?jǐn)?shù)50%乙醇溶液溶解，溶液定容至100mL，配制成0.2mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液。分別吸取0.2mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL置于6個(gè)25mL容量瓶中，依次編號(hào)0～5；各加5% NaNO2溶液0.4mL，搖勻，放置6min；然后各加10% Al(NO3)3溶液0.4mL，搖勻，放置6min；然后再各加1mol/L NaOH溶液4mL，最后用50%乙醇溶液定容至刻度線，搖勻，放置15min，于波長(zhǎng)510nm處測(cè)定吸光度，回歸方程為：

式中：A為吸光度；C為蘆丁質(zhì)量濃度/(mg/mL)。

1.3.3 樣品中黃酮類化合物的測(cè)定

將發(fā)芽糙米用微粉碎機(jī)粉碎，過(guò)100目篩。準(zhǔn)確稱取2g樣品置于100mL小燒杯中，按照一定的料液比加入提取溶劑，將燒杯放入水浴恒溫振蕩器中恒溫振蕩浸提，然后5000r/min離心10min，取2mL上清液于25mL容量瓶中，按照NaNO2-Al(NO3)3法測(cè)定吸光度，然后按照下式計(jì)算出發(fā)芽糙米黃酮提取量(以蘆丁計(jì))[15]。

式中：Y為黃酮提取量/(mg/g)；A為吸光度；V為二次離心之后的上清液體積/mL；m為樣品質(zhì)量/g。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析

使用Design-Export 7.0.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行響應(yīng)面分析及模型擬合。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲時(shí)間對(duì)發(fā)芽糙米黃酮提取的影響

在發(fā)芽糙米黃酮提取過(guò)程中，超聲波處理對(duì)物料的破壁作用明顯，對(duì)黃酮的提取率有影響，因此將超聲時(shí)間作為單因素來(lái)考察。以體積分?jǐn)?shù)50%乙醇溶液為提取溶劑，取液料比為20:1(mL/g)，分別考察超聲時(shí)間為6、9、12、15、18min的條件下的發(fā)芽糙米黃酮提取量，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 超聲時(shí)間對(duì)黃酮提取量的影響Fig.1 Effect of ultrasound treatment time on extraction rate of flavonoids

由圖1可知，發(fā)芽糙米黃酮的提取量隨著超聲時(shí)間的增加而增加，但12min后隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，可能是超聲對(duì)黃酮的破壞或者其他的因素引起的，因此選取超聲處理12min較為合適。

2.2 浸提溫度對(duì)發(fā)芽糙米黃酮提取的影響

以體積分?jǐn)?shù)50%的乙醇溶液為提取溶劑，取液料比為20:1，超聲處理12min后分別在25、35、45、55、65℃條件下提取30min，結(jié)果如圖2所示。

圖2 浸提溫度對(duì)黃酮提取量的影響Fig.2 Effect of temperature on extraction rate of flavonoids

由圖2可知，隨著溫度的升高，黃酮提取量顯著增加，但是45℃后增加趨于平緩略有下降，考慮到高溫可能改變物質(zhì)結(jié)構(gòu)和使體系發(fā)生其他反應(yīng)，取45℃為最佳浸提溫度。

2.3 浸提時(shí)間對(duì)發(fā)芽糙米黃酮提取的影響

以液料比20:1加入體積分?jǐn)?shù)50%的乙醇溶液，在45℃條件下分別提取20、30、40、50、60min，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，隨著浸提時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)芽糙米黃酮提取量在30min內(nèi)顯著增加，此后浸提時(shí)間對(duì)黃酮的提取量影響很小。從操作費(fèi)用和能源消耗考慮，因此初步確定30min為最佳浸提時(shí)間。

圖3 浸提時(shí)間對(duì)發(fā)芽糙米黃酮提取量的影響Fig.3 Effect of extraction time on extraction rate of flavonoids

2.4 液料比對(duì)發(fā)芽糙米黃酮提取的影響

液料比對(duì)黃酮的溶出有直接的影響，也會(huì)對(duì)黃酮的提取造成影響。因此取不同的液料比，以體積分?jǐn)?shù)50%的乙醇溶液為提取劑，超聲處理12min后在45℃條件下提取30min，結(jié)果如圖4所示。

圖4 液料比對(duì)發(fā)芽糙米黃酮提取量的影響Fig.4 Effect of material/liquid ratio on extraction rate of flavonoids

從圖4可知，隨著液料比的增加，黃酮的提取量在不斷的增高，這是因?yàn)樵黾右毫媳?，傳質(zhì)動(dòng)力增加，黃酮就更容易溶出，損失減少；但液料比大于20:1后增加速度趨于平緩。因此考慮經(jīng)濟(jì)效益，選取液料比為20:1(mL/g)。

2.5 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)

2.5.1 試驗(yàn)因素水平編碼與試驗(yàn)結(jié)果

綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原則，以黃酮提取量為響應(yīng)值，分析超聲處理時(shí)間、浸提溫度、浸提時(shí)間、料液比四因素三水平的響應(yīng)面分析方法，各因素及水平編碼如表1所示。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 超聲波輔助提取發(fā)芽糙米黃酮工藝響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels tested in response surface analysis

表2 超聲波輔助提取發(fā)芽糙米黃酮工藝響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

2.5.2 數(shù)據(jù)分析及模型建立

表3 二次響應(yīng)面回歸模型方差分析及顯著性檢驗(yàn)結(jié)果Table 3 ANOVA for the developed regression model

應(yīng)用Design-Expert軟件，對(duì)表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合分析，選擇對(duì)響應(yīng)值影響顯著的各項(xiàng)，可得二次回歸方程為：

對(duì)回歸方程進(jìn)行方差分析及顯著性檢驗(yàn)的結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，該回歸模型顯著(P＜0.0001)方程的一次性和二次項(xiàng)的影響都顯著，且交互項(xiàng)AB、AD、BC也顯著，且該模型的R2＝0.9679，R2Adj＝0.9359，說(shuō)明該模型與試驗(yàn)值擬合較好，可用于發(fā)芽糙米黃酮提取量評(píng)定的理論依據(jù)。

2.5.3 響應(yīng)面因素水平的優(yōu)化

回歸方程中影響顯著的交互項(xiàng)所做的響應(yīng)曲面區(qū)及其等高線圖見(jiàn)圖5。

圖5 各兩因素交互作用對(duì)發(fā)芽糙米黃酮提取量影響的響應(yīng)面及等高線圖Fig.5 Response surface and contour plots showing the effects of pairwise interactions among various process conditions on extraction rate of flavonoids

通過(guò)該組圖即可對(duì)任何兩個(gè)因素交互影響發(fā)芽糙米黃酮提取量的效應(yīng)進(jìn)行分析和評(píng)價(jià)。通過(guò)矩陣分析得響應(yīng)值Y有最大值時(shí)各因素的水平為A＝－0.1、B＝0.08、C＝0.05、D＝－0.22，轉(zhuǎn)換后可得發(fā)芽糙米黃酮的最佳提取條件為超聲時(shí)間11.7min、浸提溫度45.8℃、浸提時(shí)間30.5min、液料比18.9:1(mL/g)，此時(shí)黃酮提取量為0.754mg/g。

2.6 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

對(duì)最佳提取工藝進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得發(fā)芽糙米黃酮提取量實(shí)測(cè)值為(0.743±0.011)mg/g(n＝5)，比理論值0.754mg/g稍低，說(shuō)明由于試驗(yàn)條件的限制，回歸模型中還存在一些干擾因素。

3 結(jié) 論

采用Box-Behnken響應(yīng)面法建立影響因素的二次回歸模型，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到發(fā)芽糙米黃酮的最佳提取工藝為超聲時(shí)間11.7min、浸提溫度45.8℃、浸提時(shí)間30.5min、料液比18.9:1(mL/g)，試驗(yàn)誤差小，可用來(lái)實(shí)際預(yù)測(cè)和評(píng)價(jià)發(fā)芽糙米黃酮提取量的理論依據(jù)。

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Optimization of Ultrasound-Assisted Extraction of Flavonoids from Germinated Brown Rice Using Response Surface Methodology

LIU Zhen-chun，ZHANG Li-kuan，YU Chang，F(xiàn)ENG Jian-guo
(College of Food Science and Technology, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)

Total flavonoids were extracted from geminated brown rice by ultrasound-assisted extraction method using 50%ethanol as extraction solvent. Response surface methodology was employed to optimize the extraction conditions based on extraction rate. A quadratic regression model describing the effects of four process conditions on the extraction rate of total flavonoids was developed using a Box-Behnken experimental design. The response surface analysis showed that the optimal extraction conditions were extraction for 30.5 min at 45.8 ℃ and a material/liquid ratio of 18.9:1 (mL/g) after 11.7 min of ultrasound treatment. Under these conditions, the average extraction rate of total flavonoids was (0.743 ± 0.011) mg/g (n = 5),accounting for 98.5% of the predicted value, 0.754 mg/g. The developed regression model showed excellent goodness of fit.

germinated brown rice；flavonoids；ultrasound；response surface methodology (RSM)

TS201.2

A

1002-6630(2012)08-0080-05

2011-03-25

吉林省科技廳重點(diǎn)項(xiàng)目(2010026)

劉振春(1963—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称窢I(yíng)養(yǎng)與功能性食品。E-mail：liuzhenchun63@163.com