宋迤明， 張曉陽， 董夏夢(mèng)， 韋 鳳，藍(lán)麗精， 蔡琪敏， 蔣冬花

(1.浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江 金華 321004;2.金華市環(huán)境檢測(cè)中心，浙江 金華321013)

白蟻鏈霉菌ACT-2菌株抗菌譜及其發(fā)酵液抑菌穩(wěn)定性分析＊

宋迤明1， 張曉陽2， 董夏夢(mèng)1， 韋 鳳1，藍(lán)麗精1， 蔡琪敏1， 蔣冬花1

(1.浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江 金華 321004;2.金華市環(huán)境檢測(cè)中心，浙江 金華321013)

測(cè)定了白蟻鏈霉菌(Streptomyces termitum)ACT-2菌株的抗菌譜.結(jié)果表明：ACT-2菌株對(duì)細(xì)菌類病原體有較強(qiáng)的拮抗能力，對(duì)真菌類病原菌抑菌效果不顯著.以水稻白葉枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)P6生理小種為指示菌，分析了ACT-2菌株發(fā)酵液的抑菌穩(wěn)定性.ACT-2菌株發(fā)酵液抑菌穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)顯示：在溫度低于80℃，4 000 lx光照強(qiáng)度下，ACT-2菌株發(fā)酵液能保持穩(wěn)定的抑菌能力;溫度高于90℃時(shí)，其發(fā)酵液的抑菌能力開始降低;經(jīng)酸堿處理后，其發(fā)酵液的抑菌能力出現(xiàn)了明顯的降低.

白蟻鏈霉菌;白葉枯病;抗菌譜;穩(wěn)定性

放線菌，尤其鏈霉菌，廣泛存在于土壤環(huán)境中，并大范圍應(yīng)用于抗生素的生產(chǎn)［1］.鏈霉菌菌株可產(chǎn)生約6 550種抗生素類物質(zhì)，約占由放線菌產(chǎn)生抗生素總量的70%［2-3］.這些抗生素類物質(zhì)屬于鏈霉菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物，可以在自然環(huán)境中發(fā)生降解［4］，且可以特異性地作用于某些病原菌，降低由該病原菌所致病害的發(fā)病率.因此，這類鏈霉菌可作為生防菌，應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中［5］.

白蟻鏈霉菌ACT-2菌株篩選自金華市郊區(qū)水稻試驗(yàn)田土壤中，通過打孔法和牛津杯法實(shí)驗(yàn)，表明該菌對(duì)水稻白葉枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)P6的生長(zhǎng)和繁殖具有較強(qiáng)的抑制作用.本研究對(duì)ACT-2菌株的抗菌譜及其發(fā)酵液抑菌能力的穩(wěn)定性進(jìn)行了探討，為該生防菌株的應(yīng)用和發(fā)酵液中有效組分的分離純化、加工儲(chǔ)藏提供參考.

1 材料與方法

1.1 供試菌株

水稻白葉枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)P6生理小種，由浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院遺傳實(shí)驗(yàn)室提供;白蟻鏈霉菌(Streptomyces termitum)ACT-2菌株，分離自浙江省金華市郊區(qū)水稻試驗(yàn)田;金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)、大腸埃希氏菌(Escherichia coli)、黃瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum)、苦瓜枯萎病菌(Fusarium semitectum)、番茄早疫病菌(Alternaria sonali)、稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)、稻曲病菌(Ustilaginoidea virens)、水稻紋枯病菌(Rhizoctonia solani)、楊樹潰瘍病菌(Botryosphaeria dothidea)、煙草赤星病菌(Alternaria alternata)和小麥赤霉病菌(Fusarium graminearum)由本實(shí)驗(yàn)室保存.

1.2 發(fā)酵液的制備

從固體培養(yǎng)基白蟻鏈霉菌ACT-2菌落上刮取少量的孢子，接入裝有高氏一號(hào)液體培養(yǎng)基的250 mL 搖瓶中(裝液量為50 mL，pH 7.2 ～ 7.5)，180 r/min 28℃搖床培養(yǎng)36 h，作為種子液.取100 μL種子培養(yǎng)液，以0.2%的接種量加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，250 mL搖瓶裝液量為50 mL，發(fā)酵液初始pH調(diào)至7.5，搖床轉(zhuǎn)速為180 r/min，28℃恒溫培養(yǎng)72 h.發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液置于50 mL離心管中10 000 r/min離心10 min，上清液通過孔徑為0.22 μm細(xì)菌過濾膜過濾，重復(fù)2次，除去殘余孢子.

1.3 抗菌譜的測(cè)定

1.3.1 “十”字交叉法

參見文獻(xiàn)［6］.將上述上清液與融化的PDA固體培養(yǎng)基以1∶9的體積比混合均勻，倒入滅菌的培養(yǎng)皿中，制成帶藥平板.用打孔法移取直徑5 mm帶有待測(cè)病原菌的菌餅到凝固后的培養(yǎng)基上，于28℃培養(yǎng)72 h，用“十”字交叉法測(cè)量供試病原菌菌落的生長(zhǎng)直徑，并計(jì)算菌絲生長(zhǎng)抑制率.設(shè)置3組平行測(cè)定，取平均值.

1.3.2 牛津杯法

參見文獻(xiàn)［7］.在無菌的培養(yǎng)皿內(nèi)加入20 mL培養(yǎng)基，凝固后將病原菌培養(yǎng)液均勻涂布在培養(yǎng)基表面，在中心放置1個(gè)滅菌的牛津杯，每個(gè)牛津杯中加入200 μL白蟻鏈霉菌ACT-2菌株發(fā)酵液，將培養(yǎng)皿置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，測(cè)定抑菌圈的直徑.每個(gè)處理重復(fù)3次，取平均值.

1.4 ACT-2菌株發(fā)酵液抑菌穩(wěn)定性的分析

1.4.1 熱穩(wěn)定性

將白蟻鏈霉菌ACT-2菌株發(fā)酵濾液分別置于 50，60，70，80 和90 ℃條件下處理2 h.

1.4.2 酸堿穩(wěn)定性

分別用1 mol/L NaOH溶液和1 mol/L HCl溶液將ACT-2菌株發(fā)酵濾液pH標(biāo)定至2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0 和 10.0，處理 2 h，再將發(fā)酵濾液調(diào)回其原始pH 7.8.

1.4.3 光穩(wěn)定性

將ACT-2菌株發(fā)酵濾液置于光強(qiáng)度為4 000 lx 的光源下，分別照射3，6，9，12，15 和18 h.

以ACT-2菌株原始發(fā)酵濾液為對(duì)照，以水稻白葉枯病菌P6生理小種作為指示菌，用牛津杯法測(cè)定上述經(jīng)熱、酸堿或光照處理發(fā)酵濾液的抑菌率，重復(fù)3次.

2 結(jié)果與分析

2.1 ACT-2菌株發(fā)酵液的抗菌譜

由表1可知，ACT-2菌株發(fā)酵液對(duì)真菌類病原菌具有一定的抑制作用，但是抑菌作用較弱.在所選測(cè)試的9種植物病原真菌中，對(duì)黃瓜枯萎病菌的抑制作用最強(qiáng)，抑菌率達(dá)40.91%;對(duì)稻曲病菌的抑制作用最弱，抑菌率為28.73%.

表1 白蟻鏈霉菌ACT-2菌株發(fā)酵液對(duì)植物病原真菌的抑菌率

表2反映了ACT-2菌株發(fā)酵液對(duì)病原細(xì)菌的抑制能力.通過牛津杯法測(cè)試，ACT-2菌株發(fā)酵液對(duì)所選4種病原細(xì)菌的抑菌圈直徑均達(dá)到20.00 mm以上，抑菌效果比較好.

表2 白蟻鏈霉菌ACT-2菌株發(fā)酵液對(duì)病原細(xì)菌的抑菌作用

2.2 ACT-2菌株發(fā)酵液的熱穩(wěn)定性

圖1 ACT-2菌株發(fā)酵液在不同溫度處理后對(duì)白葉枯病菌P6生理小種的抑菌作用

由圖1可知：溫度為50～70℃時(shí)，ACT-2菌株發(fā)酵液的抑菌活性與對(duì)照相近;當(dāng)溫度升高到80℃時(shí)，發(fā)酵液的抑菌活性略有下降;當(dāng)溫度升高到90℃時(shí)，發(fā)酵液的抑菌圈直徑為22.00 mm，比對(duì)照組(抑菌圈直徑為24.83 mm)的抑菌活性有較顯著的下降.表明ACT-2菌株發(fā)酵液在溫度低于80℃環(huán)境下有較好的穩(wěn)定性，但溫度高于90℃則可能對(duì)發(fā)酵液中的活性物質(zhì)造成一定的破壞.

2.3 ACT-2菌株發(fā)酵液的酸堿穩(wěn)定性

由圖2可知：ACT-2菌株發(fā)酵液在pH 2.0，3.0，4.0，5.0 和 6.0 環(huán)境下處理2 h 后，發(fā)酵液的抑菌能力均有一定程度的下降，抑菌圈直徑隨pH值的降低而減小，在pH 2.0時(shí)抑菌圈直徑最小，為17.56 mm;當(dāng) pH 在9.0 ～10.0 時(shí)，抑菌圈直徑隨著pH值的增大而減小，而且堿性越強(qiáng)抑菌圈直徑減小得越多，在 pH 9.0時(shí)抑菌圈直徑為22.56 mm，在 pH 10.0 時(shí)抑菌圈直徑為 21.11 mm.ACT-2菌株發(fā)酵液在 pH 7.0～8.0時(shí)抑菌圈直徑?jīng)]有顯著差異.表明ACT-2菌株發(fā)酵液活性物質(zhì)的抑菌能力受酸堿度影響較大，但是由于在pH 2.0和pH 10.0時(shí)仍具有一定的抑菌活性，說明該活性物質(zhì)對(duì)酸堿環(huán)境仍具有一定的耐受性.

圖2 ACT-2菌株發(fā)酵液在不同酸堿環(huán)境處理后對(duì)白葉枯病菌P6生理小種的抑菌作用

圖3 ACT-2菌株發(fā)酵液在不同時(shí)間光照處理后對(duì)白葉枯病菌P6生理小種的抑菌作用

2.4 ACT-2菌株發(fā)酵液的光穩(wěn)定性

由圖3可知，白蟻鏈霉菌ACT-2菌株發(fā)酵液于28 ℃下用 4 000 lx光照處理 3，6，9，12，15 和18 h后，發(fā)酵液的抑菌能力沒有顯著差異.表明ACT-2菌株發(fā)酵液中的抑菌物質(zhì)對(duì)光較穩(wěn)定.

3 討論

研究結(jié)果表明，白蟻鏈霉菌ACT-2菌株對(duì)多種導(dǎo)致植物病害的病原菌均有一定程度的抑制作用，尤其是對(duì)細(xì)菌類病原菌的作用效果更明顯.國(guó)內(nèi)有一些有關(guān)放線菌抑菌作用的相關(guān)報(bào)道，如邵彥坡等［8］發(fā)現(xiàn)的海洋放線菌B5菌株和張玲玲等［9］發(fā)現(xiàn)的土壤放線菌C3-1菌株等，對(duì)真菌類病原菌表現(xiàn)出比較強(qiáng)烈的抑制作用.與這些報(bào)道不同的是，白蟻鏈霉菌ACT-2菌株篩選自金華市郊外水稻試驗(yàn)田，對(duì)細(xì)菌類病原菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的拮抗作用.因此，開發(fā)利用白蟻鏈霉菌ACT-2菌株防治水稻白葉枯病菌具有較好的前景.

嵇豪等［10］的研究發(fā)現(xiàn)，生物活性物質(zhì)的加工和儲(chǔ)藏容易受到該物質(zhì)穩(wěn)定性的影響;汪茜等［11］認(rèn)為生物活性物質(zhì)能否發(fā)揮有效作用與其自身的穩(wěn)定性有密切關(guān)系.通過對(duì)白蟻鏈霉菌ACT-2菌株發(fā)酵液穩(wěn)定性的研究，表明該菌株發(fā)酵液對(duì)光照和溫度表現(xiàn)出較好的穩(wěn)定性，可以耐受一定程度的高溫;對(duì)酸堿度的耐受性稍差一些，本研究數(shù)據(jù)顯示，ACT-2菌株發(fā)酵液的抑菌活性下降幅度并不明顯，穩(wěn)定性較高.這使該菌株發(fā)酵液的生防應(yīng)用，以及其中有效組分的分離純化和加工儲(chǔ)藏成為可能.

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Antimicrobial spectrum of Streptomyces termitum strain ACT-2 and antibacterial stability of its fermentation broth

SONG Yiming1， ZHANG Xiaoyang2， DONG Xiameng1， WEI Feng1，LAN Lijing1， CAI Qimin1， JIANG Donghua1

(1.College of Chemistry and Life Science，Zhejiang Normal University，Jinhua Zhejiang 321004，China;2.Environmental Monitoring Center of Jinhua，Jinhua Zhejiang 321013，China)

The results of bacteriostasis experiments demonstrated that strain ACT-2 suppressed a wide range of bacterial pathogens in vitro，while no obvious antimicrobial activities towards fungal pathogens.Antibacterial stability of Streptomyces termitum strain ACT-2 fermentation broth was studied while Xanthomonas oryzae pv.oryzae physiological strain P6 was chosen as indicator bacteria.The fermentation broth could show obvious bacteriostatic activity when the tempreture was below 80℃or exposured in the 4 000 lx illuminant;the diameter of inhibition zone decreased when the tempreture came up to 90℃.The fermentation broth was sensitive to acidity and alkalinity，the activity decreased after treatment.

Streptomyces termitum;bacterial leaf blight;antimicrobial spectrum;stability

Q939.92

A

2012-02-14

浙江省公益性技術(shù)應(yīng)用研究計(jì)劃項(xiàng)目(2010C32076)

宋迤明(1986－)，男，山東梁山人，碩士研究生.研究方向：應(yīng)用微生物學(xué).

蔣冬花.E-mail：jdh@zjnu.cn

(責(zé)任編輯 薛 榮)