倪文兵，童軍茂

（石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子 832000）

紅棗多酚氧化酶酶促褐變控制研究

倪文兵，童軍茂*

（石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子 832000）

確定了紅棗多酚氧化酶最適pH為6.0～6.5，最適溫度為27℃;其對(duì)pH和溫度較為敏感，通過(guò)調(diào)節(jié)pH和適當(dāng)?shù)臒崽幚砑纯捎行б种破浠钚浴Ｍ瑫r(shí)在上述最適條件下，研究了以檸檬酸、抗壞血酸、亞硫酸鈉作為抑制劑對(duì)紅棗多酚氧化酶的抑制作用，并在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析法對(duì)復(fù)合抑制劑的復(fù)配進(jìn)行了優(yōu)化，獲得最佳添加配比為:檸檬酸0.24%，抗壞血酸0.14%，亞硫酸鈉0.08%;此條件下紅棗多酚氧化酶相對(duì)殘余酶活為0.51%。

多酚氧化酶，抗壞血酸，響應(yīng)面，復(fù)配抑制劑

在果蔬加工過(guò)程中，酶促褐變是引起顏色變化的原因之一，而多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）則是引起酶促褐變的主要酶［1］。紅棗（Ziziphus jujube M ill.）又名大棗、大紅棗，未成熟時(shí)為黃綠色，成熟后呈紅色，主產(chǎn)于我國(guó)，具有很高的營(yíng)養(yǎng)保健價(jià)值;其酶促褐變主要是由于紅棗組織中的多酚氧化酶催化酚類物質(zhì)氧化形成醌類物質(zhì)，醌類物質(zhì)聚合生成黑色素，造成果實(shí)組織褐變，從而影響紅棗加工制品的感官品質(zhì)。本研究以新疆和田大棗為對(duì)象，確定大棗酶促褐變的控制方法，并選用檸檬酸、抗壞血酸、亞硫酸鈉作為大棗多酚氧化酶活性的抑制劑，通過(guò)運(yùn)用響應(yīng)面分析法對(duì)大棗多酚氧化酶抑制劑的復(fù)配進(jìn)行優(yōu)化，從而獲得防褐變效果較優(yōu)的復(fù)合抑制劑，為紅棗深加工過(guò)程中褐變的控制提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅棗 購(gòu)于新疆阿克蘇市;鄰苯二酚 天津市化學(xué)試劑三廠，分析純;磷酸氫二鈉 天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，分析純;磷酸二氫鈉、檸檬酸、抗壞血酸、亞硫酸鈉 天津市巴斯夫化工有限公司，分析純;蒸餾水 實(shí)驗(yàn)室提供，分析純。

UV759紫外－可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司;HH－42快速恒溫?cái)?shù)顯水箱 常州國(guó)華電器有限公司;MA110分析天平 上海第二天平儀器廠;EL204電子天平 梅特勒－托利多儀器（上海）有限公司;Neofuge 15R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)力康發(fā)展有限公司;HI8424便攜式pH測(cè)定儀 哈納儀器有限公司;JJ－2組織搗碎機(jī) 上海比朗儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)流程 紅棗→篩選、清洗→去皮、去核→搗碎勻漿→高速離心→多酚氧化酶活性測(cè)定

1.2.2 紅棗多酚氧化酶的制備 紅棗清洗后瀝干，去核去皮，在 4℃下取 100g紅棗果肉組織加入400m L蒸餾水，組織搗碎機(jī)勻漿2m in，然后在4℃、10000 r/m in條件下冷凍離心30m in，分離上清液，即為酶液，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 紅棗多酚氧化酶的測(cè)定 采用分光光度法，取制備的紅棗多酚氧化酶酶液，以鄰苯二酚作為反應(yīng)底物，在420nm波長(zhǎng)下測(cè)定反應(yīng)體系的吸光度，并計(jì)算多酚氧化酶酶活及相對(duì)殘余酶活。吸光度越大，表明褐變?cè)絿?yán)重。

酶活力定義［2］:反應(yīng)體系中，1m L酶液反應(yīng)1m in吸光度增加0.001定義為一個(gè)酶活力單位U。

相對(duì)殘余酶活［3］（%）=處理后酶液的酶活/酶液的原始酶活×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 紅棗多酚氧化酶活性隨反應(yīng)進(jìn)程變化規(guī)律

取1m L酶液，加入3m L pH 6.8的磷酸鹽緩沖溶液，然后再加入1m L 0.1mol/L的鄰苯二酚，混勻后在25℃條件下反應(yīng)，每間隔1m in測(cè)一次420nm波長(zhǎng)處反應(yīng)體系的吸光值，結(jié)果如圖1所示。反應(yīng)在初始階段速度很快，紅棗多酚氧化酶活性隨反應(yīng)的進(jìn)行呈直線上升;5m in后反應(yīng)速度逐漸放緩，酶活有所降低，這可能與酶作用底物的消耗和產(chǎn)物的積累以及吸光度隨時(shí)間的推移變化率減小有關(guān)，因而4m in后，隨時(shí)間的增加酶的活性不能由反應(yīng)進(jìn)程完全表征出來(lái)，所以實(shí)驗(yàn)確定反應(yīng)時(shí)間以4m in為最佳。另外，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，吸光度逐漸增大，則表明反應(yīng)時(shí)間越長(zhǎng)褐變?cè)矫黠@。

圖1 紅棗多酚氧化酶活性隨反應(yīng)時(shí)間的變化Fig.1 Changes of PPO activity from Chinese jujube with reaction time

2.2 反應(yīng)pH對(duì)紅棗多酚氧化酶的影響

取1m L酶液，加入3m L不同pH的磷酸鹽緩沖溶液，再加入1m L 0.1mol/L的鄰苯二酚，混勻后在25℃條件下反應(yīng)4min，測(cè)定420nm波長(zhǎng)處反應(yīng)體系的吸光度。緩沖溶液分別采取 pH為2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0十三個(gè)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。紅棗多酚氧化酶受pH影響較大，在pH 5.5～7.0時(shí)活性較高;通過(guò)非線性回歸分析預(yù)測(cè)pH 6.3時(shí)酶活性達(dá)到最大，經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證可確定最適pH為6.0～6.5;當(dāng)pH為4.0時(shí)紅棗多酚氧化酶活性受到有效抑制，而在pH小于3.0條件下酶活幾乎喪失，因而可以通過(guò)調(diào)節(jié)pH提高酸度來(lái)降低多酚氧化酶活性從而有效防止褐變。

2.3 反應(yīng)溫度對(duì)紅棗多酚氧化酶的影響

取1m L酶液，加入3m L pH 6.8的磷酸鹽緩沖溶液，再加入1m L 0.1mol/L的鄰苯二酚，混勻后在不同溫度條件下反應(yīng)4m in，測(cè)定420nm波長(zhǎng)處反應(yīng)體系的吸光度，結(jié)果如圖3所示。紅棗多酚氧化酶受溫度影響較為顯著，其作用的適宜溫度為20～40℃，經(jīng)非線性回歸分析得到在27℃時(shí)活性最高，其后隨著溫度的增加酶活急劇降低，60℃后多酚氧化酶受高溫作用逐漸失活，因而可以通過(guò)適當(dāng)?shù)臒崽幚韥?lái)有效抑制紅棗多酚氧化酶的活性以達(dá)到防褐變的效果。

圖2 反應(yīng)pH對(duì)紅棗多酚氧化酶活性影響Fig.2 Effect of reaction pH on PPO activity from Chinese jujube

圖3 反應(yīng)溫度對(duì)紅棗多酚氧化酶活性影響Fig.3 Effect of reaction temperature on PPO activity from Chinese jujube

2.4 抑制劑對(duì)紅棗多酚氧化酶活性的影響

選用檸檬酸、抗壞血酸、亞硫酸鈉作為多酚氧化酶活性的抑制劑，以pH 6.3的磷酸緩沖液配制不同濃度的抑制劑溶液。取1m L酶液，加入1m L不同濃度的抑制劑溶液（抑制劑的加入量以提取酶液前的紅棗重量為基準(zhǔn)）、2m L pH 6.3磷酸緩沖液，再加入1m L 1%的鄰苯二酚，混勻后27℃條件下反應(yīng)4m in，在420nm波長(zhǎng)處測(cè)定反應(yīng)體系的吸光度，并計(jì)算紅棗多酚氧化酶相對(duì)殘余酶活。

檸檬酸添加量分別取 0.01%、0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%六個(gè)水平;抗壞血酸添加量分別取0.01%、0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.3%六個(gè)水平;亞硫酸鈉添加量分別取 0.01%、0.03%、0.05%、0.07%、0.1%、0.2%六個(gè)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4～圖6所示。

圖4 檸檬酸添加量對(duì)紅棗多酚氧化酶活性的影響Fig.4 Effect of amount of citric acid on PPO activity from Chinese jujube

三種抑制劑對(duì)紅棗多酚氧化酶都有一定的抑制作用，其中亞硫酸鈉和抗壞血酸的抑制效果較為顯著，而檸檬酸的用量相對(duì)較大，相當(dāng)于在普通食品中作為酸味調(diào)節(jié)劑的用量。多酚氧化酶是以銅離子為輔基的金屬蛋白酶［4］。檸檬酸對(duì)紅棗多酚氧化酶活性的影響首先是通過(guò)調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH實(shí)現(xiàn)的，當(dāng)添加量為0.01%時(shí)能提高多酚氧化酶活性，而隨著用量的增加，反應(yīng)體系pH逐漸降低從而對(duì)多酚氧化酶產(chǎn)生抑制效果;其次，檸檬酸含有三個(gè)羧基，對(duì)金屬離子有很強(qiáng)的螯合作用，它能與多酚氧化酶中的銅輔基絡(luò)合使酶鈍化從而減緩褐變?？紤]到在紅棗加工過(guò)程中對(duì)制品口味的影響，以及酸度的適宜性，作為褐變抑制劑的檸檬酸的添加量選擇在0.1%～0.3%。

圖5 抗壞血酸添加量對(duì)紅棗多酚氧化酶活性的影響Fig.5 Effect of amount of ascorbic acid on PPO activity from Chinese jujube

圖6 亞硫酸鈉添加量對(duì)紅棗多酚氧化酶活性的影響Fig.6 Effect of amount of sodium sulfite on PPO activity from Chinese jujube

抗壞血酸對(duì)紅棗多酚氧化酶具有較好的抑制作用，0.05%的添加量即有顯著的防褐變效果，這是因?yàn)榭箟难嵊休^強(qiáng)的還原性，不僅能消耗反應(yīng)體系中的氧，減少不良氧化物的產(chǎn)生，還能還原在多酚氧化酶作用下由酚類物質(zhì)產(chǎn)生的醌類物質(zhì)，防止其進(jìn)一步生成有色物質(zhì)。另外，抗壞血酸是紅棗的固有營(yíng)養(yǎng)成分，安全性高，是防褐變的理想制劑。但當(dāng)抗壞血酸添加量超過(guò)0.15%時(shí)，其自身又容易發(fā)生非酶促褐變，所以其添加量應(yīng)適當(dāng)控制，以0.05%～0.15%為宜。

亞硫酸鈉對(duì)紅棗多酚氧化酶的抑制作用很明顯。其除了能清除反應(yīng)體系中的氧外，還能與酶促褐變中間產(chǎn)物醌類不可逆加成生成無(wú)色物質(zhì)，并且還有防止微生物污染的作用［5］。當(dāng)亞硫酸鈉的添加量為0.2%時(shí)，紅棗多酚氧化酶的相對(duì)殘余酶活為零，這可能與亞硫酸鈉的漂白作用有關(guān)。由于它破壞營(yíng)養(yǎng)，且有害健康，其使用已受到限制［6］，選擇用量控制在0.1%以內(nèi)。

2.5 響應(yīng)面分析法優(yōu)化抑制劑的復(fù)配

考慮到單一抑制劑往往不能取得理想的防褐變效果，而且用量相對(duì)較大，復(fù)合抑制劑則在一定程度上能彌補(bǔ)這兩方面的不足。又由于檸檬酸與抗壞血酸、亞硫酸鈉復(fù)合使用對(duì)多酚氧化酶的抑制效果具有協(xié)同增效作用［1］，而且亞硫酸鈉也能保護(hù)抗壞血酸不被氧化［5］，復(fù)配使用抑制效果更為顯著。根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)所確定的檸檬酸、抗壞血酸以及亞硫酸鈉的添加量水平范圍，以紅棗多酚氧化酶相對(duì)殘余酶活為指標(biāo)，采用Design－Expert 7.1軟件為實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分析的輔助手段，運(yùn)用中心組合（Cental Composite）設(shè)計(jì)原理進(jìn)行三因素五水平響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)。響應(yīng)面分析因素水平見(jiàn)表1，響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 響應(yīng)面分析因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface analysis

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Program and test results of response surface analysis

通過(guò)Design－Expert7.1軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次多項(xiàng)式擬合以及方差分析，方差分析結(jié)果見(jiàn)表3，紅棗多酚氧化酶相對(duì)殘余酶活回歸方程為:Y= 2.22－1.01A－2.69B－0.66C+0.64AB+0.087AC+ 0.64BC+0.78A2+0.86B2+0.28C2。

P值是檢驗(yàn)回歸系數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)P＜0.05時(shí)表明該項(xiàng)指標(biāo)顯著。從變量和響應(yīng)值之間的方差分析可知（見(jiàn)表3）:A、B、C、AB、BC、A2、B2達(dá)到了顯著水平。在各影響因素中，一次項(xiàng)抗壞血酸添加量（B）影響最大，其下依次是一次項(xiàng)檸檬酸添加量（A）、二次項(xiàng)抗壞血酸添加量（B2）和檸檬酸添加量（A2）、亞硫酸鈉添加量（B）以及交互項(xiàng)抗壞血酸鈉與亞硫酸鈉（BC）和檸檬酸和抗壞血酸（AB）。這表明各實(shí)驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。為了直觀地表現(xiàn)復(fù)合抑制劑對(duì)紅棗多酚氧化酶的抑制效果，兩種抑制劑之間的交互作用見(jiàn)相應(yīng)的響應(yīng)面圖，如圖7～圖9所示?？箟难釋?duì)多酚氧化酶相對(duì)殘余酶活影響最為顯著，其表現(xiàn)為曲線較陡;其次是檸檬酸，其表現(xiàn)為曲線較為平滑;再次是亞硫酸鈉，隨著添加量的增大或減小，曲線斜率變化較小。

表3 響應(yīng)面二次模型方差分析Table 3 Analysis of variance in the quadraticmodel of response surface

圖7 檸檬酸和抗壞血酸交互影響紅棗多酚氧化酶的響應(yīng)面圖Fig.7 Response surface diagram of effect of interaction between citric acid and ascorbic acid on PPO activity

圖8 檸檬酸和亞硫酸鈉交互影響紅棗多酚氧化酶的響應(yīng)面圖Fig.8 Response surface diagram of effect of interaction between citric acid and sodium sulfite on PPO activity

由回歸模型的P＜0.0001可知，該模型高度顯著，表明實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)可靠。同時(shí)模型的可決系數(shù)和調(diào)整可決系數(shù)分別為0.9673、0.9380，說(shuō)明回歸方程和實(shí)驗(yàn)結(jié)果擬合較好，可以較好地描述各因素和響應(yīng)值之間的關(guān)系，所以可以利用該回歸方程確定復(fù)合抑制劑的的最佳復(fù)配參數(shù)。經(jīng)計(jì)算，最佳抑制劑添加量的編碼為:A=0.389，B=0.999，C=0.648;對(duì)應(yīng)的抑制劑添加量分別為:檸檬酸0.24%，抗壞血酸0.14%，亞硫酸鈉0.08%，此時(shí)紅棗多酚氧化酶相對(duì)殘余酶活為0.49%。經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，此條件下測(cè)得的紅棗多酚氧化酶相對(duì)殘余酶活為0.51%，與理論值0.49%相差不大。與使用單一抑制劑相比，復(fù)合抑制劑對(duì)紅棗多酚氧化酶的抑制作用顯然增強(qiáng)了很多，在低添加量情況下即可達(dá)到顯著的防褐變效果。

圖9 抗壞血酸和亞硫酸鈉交互影響紅棗多酚氧化酶的響應(yīng)面圖Fig.9 Response surface diagram of effect of interaction between ascorbic acid and sodium sulfite on PPO activity

3 結(jié)論

紅棗多酚氧化酶對(duì)pH和溫度較為敏感，最適pH為6.0～6.5，最適溫度為27℃，通過(guò)調(diào)節(jié)pH和適當(dāng)?shù)臒崽幚砑纯捎行б种破浠钚浴Ｒ詸幟仕?、抗壞血酸、亞硫酸鈉作為紅棗多酚氧化酶的抑制劑，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析法對(duì)復(fù)合抑制劑的復(fù)配進(jìn)行了優(yōu)化，獲得最佳添加配比為:檸檬酸0.24%，抗壞血酸0.14%，亞硫酸鈉0.08%;此條件下紅棗多酚氧化酶相對(duì)殘余酶活為0.51%。與使用單一抑制劑相比，復(fù)合抑制劑對(duì)紅棗多酚氧化酶的抑制作用有了顯著增強(qiáng)，在低添加量情況下即可達(dá)到顯著的防褐變效果。

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Study on enzymatic browning control of polyphenol oxidase for Chinese jujube

NIW en－bing，TONG Jun－mao*

（Food College，Shihezi University，Shihezi832000，China）

Determ ined that the op tim um pH of polyphenol oxidase（PPO）for Chinese jujube was 6.0～6.5，and the op timum tem perature 27℃.Much sensitive to the tem perature and pH，the ac tivity of PPO could be effectively inhibited by app rop riate heat treatm ent and ad justing the pH.In these op timal cond itions，the test for the controlof PPO in Chinese jujube was the add ition of citric acid，ascorb ic acid，sod ium sulfite.And on the basis of one－fac tor experiments，response surface analysis was app lied for the op tim ization of m ixing inhibitors.As a result，w ith com p lex add itives of0.24%citric acid，0.14%ascorbic acid and 0.08%sod ium sulfite added，the relative residual activity of PPO was 0.51%.

polyphenoloxidase;ascorbic acid;response surface;com posite inhibitors

TS201.2+5

A

1002－0306（2012）04－0205－04

2011－01－13 *通訊聯(lián)系人

倪文兵（1986－），男，在讀研究生，研究方向:果蔬加工與。