張 麗，張?zhí)m威，韓 雪

(哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150090)

乳酸菌胞外多糖的研究進(jìn)展

張 麗，張?zhí)m威*，韓 雪

(哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150090)

乳酸菌胞外多糖是一種天然的、具有諸多生理功能的生物高分子聚合物。乳酸菌可以產(chǎn)生不同結(jié)構(gòu)的胞外多糖，根據(jù)多糖的組成不同可以將其分為同型多糖和異型多糖。本文對(duì)乳酸菌胞外多糖的種類、結(jié)構(gòu)、生物合成、生理功能、分離純化方法以及應(yīng)用前景進(jìn)行了綜述。

胞外多糖，生物合成，生理功能，分離純化，應(yīng)用

微生物的生長(zhǎng)通常伴隨著胞外多糖(Exopolysaccharides，EPS)的產(chǎn)生。EPS具有特殊的生物學(xué)功能，它粘合在細(xì)胞表面，可以作為細(xì)胞膜的保護(hù)屏障，也可以作為生物膜的組成成分。黃原膠、硬葡聚糖、結(jié)冷膠、熱凝多糖、右旋糖苷、短梗霉多糖、細(xì)菌纖維素等都屬于胞外多糖［1］，它們已經(jīng)成功地應(yīng)用于食品、醫(yī)學(xué)、制藥、化妝品及石油行業(yè)中。乳酸菌胞外多糖是乳酸菌在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中分泌到細(xì)胞壁外常滲于培養(yǎng)基的一類多糖類化合物，分為莢膜多糖與粘液多糖，是微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物［2－3］。乳酸菌EPS有很多功能，如保護(hù)細(xì)胞體、作為膠黏劑與其他細(xì)菌表面相互作用、用作抵御環(huán)境的保護(hù)因子，在生物膜中起到結(jié)構(gòu)穩(wěn)定劑的作用等。乳酸菌EPS的結(jié)構(gòu)多樣性使其具有一系列的物理化學(xué)和生物學(xué)特性。近年來(lái)，對(duì)乳酸菌胞外多糖的研究逐漸增多［4］，乳酸菌胞外多糖作為多糖的一個(gè)重要來(lái)源也必然受到重視。本文對(duì)乳酸菌胞外多糖的種類、生物合成、生理功能、分離純化方法以及應(yīng)用前景進(jìn)行了綜述。

1 乳酸菌胞外多糖的結(jié)構(gòu)及其生物合成

1.1 乳酸菌EPS的分類及結(jié)構(gòu)

乳酸菌所產(chǎn)胞外多糖有同型多糖與異型多糖之分，同型多糖由一種單糖分子組成，異型多糖由不同種單糖構(gòu)成［2］。乳酸菌分泌的同型多糖包括葡聚糖和果聚糖，分別由葡萄糖和果糖作為唯一的單糖，其分子量在4.0×104～6.0×106之間。葡聚糖、果聚糖主要在細(xì)胞外合成［5］。一些乳酸菌如片球菌屬、酒球菌屬以及乳桿菌屬可以產(chǎn)生β－葡聚糖［6－7］;一些瑞特乳酸菌屬、清酒乳桿菌屬等可以產(chǎn)生α－葡聚糖［2］;瑞特乳酸菌亞種等可以產(chǎn)生果聚糖［2］。果聚糖主要由β鍵連接，葡聚糖主要由α或β鍵連接(圖1)。異型乳酸菌胞外多糖主干由含有7個(gè)單糖的重復(fù)單元構(gòu)成且主要由α或β鍵連接，其中葡萄糖、半乳糖和鼠李糖是主要的單糖(表1)，氨基糖、N－乙酰－D－葡萄糖胺、N－乙酰半乳糖胺，多元醇也會(huì)偶然出現(xiàn)，異型多糖的分子量分布在104～6.0 ×106之間［8］，而且結(jié)構(gòu)富有多樣性。在異型多糖合成的過(guò)程中，由于葡萄糖醛酸和磷酸鹽的參與，使得部分異型多糖呈現(xiàn)陰離子特性。一些乳酸菌如干酪乳桿菌、德式乳桿菌保加利亞亞種及乳酸乳球菌屬可以產(chǎn)生異型多糖［9］。

圖1 乳酸菌產(chǎn)生的同型多糖分類［2］Fig.1 The classification of homopolysaccharides produced by Lactobacillus sp.

1.2 乳酸菌胞外多糖的生物合成

乳酸菌EPS的生物合成取決于遺傳因素，并受微生物的培養(yǎng)環(huán)境、培養(yǎng)基的組成、pH、培養(yǎng)溫度、金屬離子、氨基酸等影響［20］。按合成位點(diǎn)與合成模式的不同，EPS的合成分為位于細(xì)胞壁外的同型多糖的合成和位于細(xì)胞膜上的異型多糖的合成。同型多糖合成由細(xì)胞外的糖基轉(zhuǎn)移酶將細(xì)胞外的單糖轉(zhuǎn)移至糖鏈上，而異型多糖的合成主要是由細(xì)胞內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶催化多個(gè)糖基核苷酸進(jìn)一步聚合輸出細(xì)胞外合成［9］。

表1 乳酸菌產(chǎn)生的異型多糖的單糖組成Table 1 The monosaccharide composition of heteropolysaccharides produced by Lactobacillus sp.

同型多糖的合成體系包括糖基供體(蔗糖)、糖基受體及葡聚糖蔗糖酶［21］。葡聚糖的合成屬單鏈反應(yīng)機(jī)制，葡聚糖蔗糖酶是一個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶，它將供體的糖苷基因轉(zhuǎn)移到受體即正在延長(zhǎng)的葡聚糖主鏈上，蔗糖可啟動(dòng)其自身的多聚化反應(yīng)，并不需要葡萄糖作為啟動(dòng)子［22］。葡聚糖的合成特點(diǎn)是以蔗糖為唯一底物，合成所需的能量來(lái)自蔗糖的水解而不是糖基核苷酸，不需載體和獨(dú)立的分支酶，產(chǎn)物分子量大［9］。

異型多糖的合成體系包括糖－核苷酸、?；w、脂中間體、酶系統(tǒng)及糖基受體五個(gè)因子［21］。在細(xì)胞膜上合成多糖需要的活性前體即各種高能態(tài)的單糖，這些高能態(tài)的單糖主要是糖基－二核苷酸，所有含葡萄糖的多聚物(除糖原外)均以UDP－D－葡萄糖為供體:乙酸、丙酮酸、3－羥基丁酸等的活性形式是?；?，為胞外多糖合成所需。異戊二烯酯中間體整合的重復(fù)單元，在原核細(xì)胞多糖合成中起作用的是焦磷酸異戊二烯酯;酶系統(tǒng)包括己糖激酶、糖基－核苷酸合成及轉(zhuǎn)移酶、糖基轉(zhuǎn)移酶、聚合酶等。異型多糖的合成始于EPS前體(糖核苷酸)在胞內(nèi)合成，之后糖核苷酸在液態(tài)載體中形成重復(fù)的單元，最后一步將重復(fù)單元從細(xì)胞膜運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞外，使之聚合成幾百到幾千個(gè)重復(fù)的單元，形成乳酸菌EPS。

與胞外多糖合成有關(guān)的酶可以分為四類［5］:第一類為參與磷酸化葡萄糖轉(zhuǎn)化成6－磷酸葡糖糖的己糖激酶和6－磷酸葡萄糖轉(zhuǎn)化成1－磷酸葡萄糖的葡萄糖磷酸變位酶;第二類為UDP－葡萄糖焦磷酸化酶，它催化1－磷酸葡萄糖轉(zhuǎn)化為尿苷二磷酸葡萄糖，此酶是胞外多糖合成中的關(guān)鍵酶;第三類為糖基轉(zhuǎn)移酶，位于細(xì)胞膜上，使UDP－葡萄糖，UDP－半乳糖以及UDP葡萄糖酸聚合并附于糖基脂質(zhì)上;第四類為葡萄糖蔗糖酶、交替蔗糖酶及果聚糖蔗糖酶，位于細(xì)胞膜外，在細(xì)胞壁附近促進(jìn)胞外多糖的合成，使得多糖分泌到細(xì)胞外葡萄糖蔗糖酶是一種葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶，它可以使蔗糖轉(zhuǎn)化成葡聚糖和D－果聚糖。交替蔗糖酶可以使蔗糖轉(zhuǎn)化成交替關(guān)系和果聚糖。果聚糖蔗糖酶可以使蔗糖轉(zhuǎn)化為D－葡聚糖和果聚糖。

2 乳酸菌EPS的生理功能

2.1 乳酸菌EPS對(duì)腫瘤的抑制作用

目前認(rèn)為乳酸菌EPS抗腫瘤作用機(jī)理有以下幾方面:a.多糖抗腫瘤作用可能影響腫瘤的血液供應(yīng)［23］;b.刺激某器官或組織，使其分泌某種物質(zhì)，以攻擊腫瘤細(xì)胞;c.體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)都表明，DEAE－右旋糖酐對(duì)腹水腫瘤有抑制效應(yīng);Abrose等［24］推測(cè)多糖的負(fù)電荷與抗腫瘤活性有關(guān)。研究者認(rèn)為腫瘤表面具有較強(qiáng)的負(fù)電荷，這些負(fù)電荷可與DEAE－右旋糖苷結(jié)合，使細(xì)胞表面的部分電荷被中和，這有利于細(xì)胞間的相互接觸，從而有利于細(xì)胞間信號(hào)的接收，進(jìn)而使細(xì)胞分裂停止。劉宇等［24］報(bào)道德氏乳桿菌保加利亞亞種OLL1073R－1有調(diào)節(jié)宿主抗腫瘤活性的作用。

2.2 乳酸菌EPS對(duì)細(xì)胞體的保護(hù)作用

莢膜多糖和黏液多糖的生理功能主要是防護(hù)作用:Buijssen K等研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌鑲嵌在黏液多糖中可以免受機(jī)械力的破壞以及抗菌物質(zhì)破壞細(xì)胞［25－27］(抗生素必須在胞外多糖中達(dá)到飽和才能到達(dá)細(xì)胞壁);Cerning J等證實(shí)黏液層可以防止細(xì)胞干裂，因?yàn)楦咚隙仁辜?xì)菌細(xì)胞在極端環(huán)境下也能存活［28］;Trevors JT等研究證明EPS可以抑制溶菌酶和防御噬菌體的進(jìn)攻［29］;此外EPS還可以螯合重金屬離子防止其毒害等［2］。

3 乳酸菌胞外多糖的分離純化

一般來(lái)講，用于乳酸菌胞外多糖分離純化的方法取決于培養(yǎng)基的成分。乳酸菌胞外多糖的提取一般分為三個(gè)步驟:EPS的分離、純化和鑒定［30］。最簡(jiǎn)單的程序是在離心去除細(xì)胞后透析培養(yǎng)基，接著凍干。從高蛋白含量的培養(yǎng)基(如脫脂乳)中獲得EPS，通常使用3種方法:三氯乙酸(TCA)沉淀(終濃度從4%到14%)、用蛋白酶消化、或者兩種方法結(jié)合。從復(fù)雜成分中分離EPS最常用的步驟是TCA沉淀，離心去除蛋白，乙醇沉淀濃縮EPS［31］。這種方法獲得的EPS的含量的最大變異系數(shù)在5%～10%之間。

除了蛋白移除和EPS沉淀，其他的技術(shù)也被用于純化EPS，包括膜過(guò)濾技術(shù)，如微濾、超濾和滲濾技術(shù)［32］;超聲波法［33］以及分子排阻色譜法［34］。此外，離子交換色譜結(jié)合凝膠滲透色譜也可分離純化多糖［35］。

Rimada等［36］認(rèn)為分離純化EPS的方法對(duì)最終EPS的含量有重大的影響。乙醇沉淀、滲析和三氯乙酸沉淀都會(huì)影響EPS的含量。盡管乙醇沉淀不能排除全部乳糖，但此方法可獲得相似的EPS含量［37］。

4 乳酸菌EPS的檢測(cè)

分離步驟后獲得凍干粉的重量是檢測(cè)EPS得率的最簡(jiǎn)單直接的指標(biāo)［11］。EPS的含量可以被表示為相當(dāng)于右旋糖酐的含量(mg/mL)，然而，由于蛋白質(zhì)和非EPS的碳水化合物同樣被量化，這種方法獲得的數(shù)值受EPS分離純化的程度影響很大。Dubois等［33，38］使用的苯酚硫酸比色法［39］被廣泛應(yīng)用于多糖含量的測(cè)定，然而苯酚－硫酸比色法檢測(cè)的是總糖含量，包括存在的低分子重量的碳水化合物。Ruijssenaars等［37］采用差減法更加精確的測(cè)定了EPS的含量，即用苯酚硫酸法測(cè)的總糖含量減去3，5－二硝基水楊酸法測(cè)定的還原糖含量來(lái)斷定EPS的含量。

理論上，比色法是最經(jīng)濟(jì)和簡(jiǎn)單的檢測(cè)多糖含量的方法，但是測(cè)量分離出來(lái)的EPS含量最精確的是分離方法和分析方法相結(jié)合的技術(shù)。因此，在HPLC中進(jìn)行凝膠液相色譜法可以通過(guò)EPS分子大小的不同分離出EPS高分子。在檢測(cè)相應(yīng)的EPS洗脫峰的同時(shí)檢測(cè)屈光指數(shù)來(lái)定量檢測(cè)EPS的產(chǎn)量［34］。

5 乳酸菌EPS的研究趨勢(shì)

5.1 高產(chǎn)EPS乳酸菌株的選育

鑒定EPS產(chǎn)生菌的方法對(duì)于尋找高產(chǎn)EPS的乳酸菌至關(guān)重要。平板上確定粘性菌群可以作為篩選高產(chǎn)EPS乳酸菌的指標(biāo)，即EPS產(chǎn)生菌的鑒定可以通過(guò)一個(gè)簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)來(lái)實(shí)現(xiàn)，用接種環(huán)挑起菌落時(shí)會(huì)出現(xiàn)細(xì)絲。著色方法也可以鑒定EPS產(chǎn)生菌，如剛果紅通過(guò)β－(1，3)或β－(1.4)非共價(jià)鍵連接多糖，釕紅是一種陽(yáng)離子著色劑，它可以連接含有羧基的酸性多糖。最近，Hassan等［2］通過(guò)顯微鏡在乳制品中直接觀察到了著色的EPS，著色的EPS使得它們?cè)跓晒鈽?biāo)記凝集素和糖蛋白方面獲得了成功［40］，因此可以利用著色的EPS尋找高產(chǎn)EPS的乳酸菌。同時(shí)，通過(guò)改變培養(yǎng)基的碳源可以提高 EPS 的產(chǎn)量［2，41］。

5.2 獲得特定流變學(xué)和生物學(xué)特性的乳酸菌EPS

遺傳工程提出了改善EPS特性的新視角。一些研究者研究了在乳酸菌EPS生物合成中發(fā)揮作用的基因簇［2］。另一種改善EPS特性的方法是控制糖基轉(zhuǎn)移酶，即使用反義RNA可以減少這種酶產(chǎn)量，雖然EPS含量不受影響，但是EPS和分子量有所改變［42］。通過(guò)對(duì)EPS進(jìn)行分子結(jié)構(gòu)修飾可以優(yōu)化其功能特性［43］。

5.3 乳酸菌EPS的構(gòu)效關(guān)系

乳酸菌EPS種類繁多，結(jié)構(gòu)復(fù)雜。結(jié)構(gòu)是其功能特性的基礎(chǔ)，研究什么樣的結(jié)構(gòu)才具有某一特定功能引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者的極大興趣。

首先，乳酸菌EPS的物理化學(xué)功能受到其結(jié)構(gòu)的影響。分子長(zhǎng)度、支鏈多少等會(huì)影響EPS分子的緊密性從而嚴(yán)重影響其流變性質(zhì)［4］。研究表明，多糖黏度大小與多聚物分子質(zhì)量有關(guān)，而胞外多糖分子質(zhì)量由組成糖基重復(fù)單元的單糖種類和數(shù)量決定［9］。其次，EPS的生物活性受到多糖的一級(jí)結(jié)構(gòu)(包括單糖組連接方式、糖苷鍵類型、分支度等)的影響?；钚远嗵堑幕瘜W(xué)結(jié)構(gòu)是其生物活性的基礎(chǔ)，也是當(dāng)前化學(xué)和糖生物學(xué)共同關(guān)注的焦點(diǎn)問(wèn)題。通過(guò)對(duì)多糖官能團(tuán)的改造，如氧化、降解、硫酸酯化等可提高或降低多糖的生物活性［44］。就多糖的一級(jí)結(jié)構(gòu)與其生物活性的關(guān)系而言，一方面多糖的糖組成和糖苷鍵類型對(duì)其生物活性有一定的影響。如從菌體中獲得的活性多糖一般由葡萄糖組成，而葡萄糖主鏈上的β－1，6－糖苷鍵是抗腫瘤所必須的。對(duì)具有抗病毒活性的硫酸酯化多糖而言，硫酸酯化均多糖的活性大于硫酸酯化雜多糖，且β－1，3－D－葡聚糖為主的多糖活性明顯高于 β－1，6－D－葡聚糖。

目前，人們發(fā)現(xiàn)許多微生物產(chǎn)生的多糖都具有抗腫瘤作用，但由于缺少這些多糖結(jié)構(gòu)特別是高級(jí)結(jié)構(gòu)的報(bào)道，目前還不能探討這些多糖抗腫瘤作用的構(gòu)效關(guān)系，但現(xiàn)已肯定的是，多糖的高級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)功能的影響比一級(jí)結(jié)構(gòu)更為重要［45－46］。Kojima 等［47］報(bào)道相對(duì)分子質(zhì)量大于100000u的高分子裂裥菌(Schizophyllum commune Fr.)多糖能形成類似的3股螺旋構(gòu)型，并且只有具有該構(gòu)型才具有活性。其抗腫瘤活性同水溶液中3螺旋結(jié)構(gòu)所占的比例有關(guān)，如3螺旋結(jié)構(gòu)低于50%，就不具有強(qiáng)的抗腫瘤活性。多糖的主鏈組成也對(duì)抗腫瘤活性的影響較大。對(duì)于葡聚糖，大多活性多糖都是具有β－(1，3)苷鍵主鏈的葡聚糖，Demleitner等［47］對(duì) curdlan(無(wú)分支(1，3)－β－葡聚糖，無(wú)生物活性)，linchenan(線性結(jié)構(gòu)，含有33%的1，3糖苷鍵、66%的1，4糖苷鍵，無(wú)生物活性)在其O－6位分別進(jìn)行修飾，加上β－D－吡喃葡萄糖基、α－L－呋喃阿拉伯糖基、α－L－鼠李糖基、β－龍膽二糖基，被修飾后的curdlan衍生物都強(qiáng)烈抑制移植性腫瘤。在另一實(shí)驗(yàn)中，被修飾加上D－呋喃阿拉伯糖酰基或D－吡喃甘露糖?；?1，3)－β－葡聚糖，都表現(xiàn)出高抗腫瘤活性［48－49］。綜上得出結(jié)論:對(duì)D－葡萄糖單元支鏈的去除和修飾都可能會(huì)造成抗腫瘤活性的變化。其原因可能是多羥基引起的氫鍵力有利于多糖高級(jí)有序構(gòu)象的維持。因此，對(duì)多糖的結(jié)構(gòu)特別是高級(jí)結(jié)構(gòu)的研究是今后的重要方向。

6 結(jié)語(yǔ)

乳酸菌EPS的多種生物學(xué)功能，吸引了各個(gè)領(lǐng)域的學(xué)者，國(guó)際上EPS專題會(huì)議已經(jīng)進(jìn)行了多次研究。EPS已廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)療等各個(gè)領(lǐng)域。利用產(chǎn)EPS的乳酸菌生產(chǎn)酸奶可改善產(chǎn)品的流變學(xué)特性，同時(shí)可不再使用被限定的穩(wěn)定劑。近年來(lái)，有關(guān)乳酸菌全基因組或部分基因組序列的提出，為乳酸菌的遺傳學(xué)、生物化學(xué)和生物學(xué)分析提供了更多的依據(jù)和信息，結(jié)合多糖合成代謝途徑調(diào)控，可以生產(chǎn)具有特定用途的EPS。

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Research and development of Lactic acid bacteria exopolysaccharides

ZHANG Li，ZHANG Lan－wei*，HAN Xue
(School of Food Science and Engineering，Harbin Institute of Technology，Harbin 150090，China)

Lactic acid bacteria exocellular polysaccharide is a natural biological polymer，which has many special physiological functions.Lactic acid bacteria have the ability to produce different kinds of exopolysaccharides(EPS)exhibiting a wide diversity of structures.EPS are classified，according to their composition into homopolysaccharides and heteropolysaccharides.The types of lactic acid bacteria exocellular polysaccharide，stucture，synthetic biology，biological function，purification methods and application prospect were reviewed in this paper.

EPS;synthetic biology;biological function;purification;adhibition

TS201.1

A

1002－0306(2012)17－0378－05

2012－03－09 *通訊聯(lián)系人

張麗(1987－)，女，碩士在讀，研究方向:食品微生物。

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃:863計(jì)劃重大項(xiàng)目/主題項(xiàng)目(2012BAD28B00)。