姚曉蕾，王玉田，孟 鑫

(遼寧醫(yī)學院食品科學與工程學院，遼寧錦州 121001)

豬肉內(nèi)源性脂肪酶三種提取方法的比較研究

姚曉蕾，王玉田*，孟 鑫

(遼寧醫(yī)學院食品科學與工程學院，遼寧錦州 121001)

比較PEG2000/(NH4)2SO4雙水相體系萃取法、反膠團提取法、雙水相萃取和殼聚糖沉淀相結(jié)合的三種方法對豬肉內(nèi)源性脂肪酶萃取效果的影響。通過正交實驗進一步優(yōu)化每一種方法的提取條件。結(jié)果表明:在PEG2000濃度25%、(NH4)2SO4濃度12%、pH6.5、殼聚糖濃度為2.5mg/mL的條件下，進行雙水相萃取和殼聚糖沉淀相結(jié)合法萃取脂肪酶的萃取效果最佳，其萃取率為97.83%，分配系數(shù)為5.209，純化倍數(shù)為7.74倍。

雙水相，反膠團，殼聚糖沉淀，內(nèi)源性脂肪酶

脂肪酶全稱為三酰甘油酯水解酶，廣泛存在于動植物和微生物體中，是一種重要的工業(yè)酶制劑。近年來，脂肪酶已被廣泛用于食品、洗滌、有機合成、皮革和造紙等行業(yè)［1－2］。其中內(nèi)源性脂肪酶(即肉品自身存在的酶)以它獨特的優(yōu)勢，顯示出廣闊的開發(fā)前景［3］。Jin等研究證實了內(nèi)源性脂肪酶在干腌培根肉的腌制和風干階段酶活性最高，對改善培根肉的風味起到重要的作用［4］。但是，傳統(tǒng)的提取內(nèi)源性脂肪酶的方法存在生產(chǎn)周期長、工藝參數(shù)不確定、所得脂肪酶活力低且不穩(wěn)定等問題。因此如何高效地提取內(nèi)源性脂肪酶已受到人們的普遍關注。雙水相萃取法、雙水相萃取和殼聚糖沉淀相結(jié)合法和反膠團提取法都是近些年來發(fā)展起來的萃取技術(shù)。由于這些提取方法均可以保護蛋白質(zhì)，使之不易變性，易于工業(yè)化連續(xù)生產(chǎn)，因而常用于酶的純化。雙水相萃取法具有含水量高、分相時間短、易于工程放大且能保護酶活等優(yōu)點，已被廣泛作為一種分離生物活性物質(zhì)的方法［5］。殼聚糖作為一種絮凝沉淀劑沉淀目標蛋白質(zhì)的效率高、用量少且安全無毒，為殼聚糖沉淀法的工業(yè)化應用奠定了基礎［6］。反膠團是溶解在有機溶劑中的表面活性劑自發(fā)形成的納米級膠體。由于水和表面活性劑在蛋白質(zhì)表面形成一層“水殼”，使蛋白質(zhì)避免與有機溶劑直接接觸而得到有效的保護［7］。本文分別采用三種方法提取豬肉內(nèi)源性脂肪酶，該酶是動物體內(nèi)一種重要的代謝酶，分子量一般為20～60ku之間，等電點一般在4.8～5.0之間，并通過正交實驗對三種提取方法進行比較探索，優(yōu)化提取條件，為豬肉內(nèi)源性脂肪酶的工業(yè)化利用建立一條快速、高效率、高活性的脂肪酶提取方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

聚乙二醇2000(PEG2000)、硫酸銨(NH4)2SO4、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、殼聚糖 國藥集團化學試劑公司，均為分析純;牛血清白蛋白、考馬斯亮藍G250 Sigma公司，均為生化試劑;冷鮮豬肉肥肉(當?shù)爻匈徺I即可)。

低速離心機 上海市離心機械研究所;恒溫水浴鍋 天津泰斯特儀器公司;組織搗碎機 南京昕航科學儀器有限公司;電子分析天平 蘭州中西儀器有限公司;紫外分光光度計 上海精密科學儀器有限公司;pH－3B型精密 pH計 上海雷磁儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 豬肉內(nèi)源性脂肪酶粗酶液的制備 將新鮮的冷卻肉用預冷4℃的蒸餾水沖洗，再用濾紙吸干，稱重5.00g，剪碎置于三角瓶中，按其重量加入10倍體積的預冷蒸餾水中，用電動勻漿機勻漿2min，再用離心機以4000r/min的速度離心20min，上清液即為粗酶液，放于4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 脂肪酶活性測定方法 采用銅皂法測酶活［8－9］。脂肪酶活力單位定義為:在一定條件下，水解脂肪每分鐘產(chǎn)生1μmol的脂肪酸，以U/mL表示。

1.2.3 蛋白質(zhì)含量的測定方法 參照考馬斯亮藍G－250 法［10］測定蛋白質(zhì)含量。

1.2.4 雙水相萃取法及其正交實驗設計 本文采用PEG2000/硫酸銨雙水相萃取體系［11］，在常溫下按質(zhì)量配制。酶液量為2g，稱取一定量PEG2000和硫酸銨，不足部分以水補充，使體系總質(zhì)量為10g，靜置15min分相。讀出上、下相體積，分別測定上下相酶活力和總蛋白含量。有關計算公式為:

式中:X為脂肪酶活力，U·mL－1;c為脂肪酸濃度μmol·mL－1;V為脂肪酸溶液的體積，mL;V'為酶液的用量，mL;t為作用時間，min。

相比R=上相體積/下相體積;

分配系數(shù)K=上相酶活/下相酶活;

萃取率C=RK/(1+RK);

比酶活=酶活/蛋白含量;

純化倍數(shù)=上相比酶活/原酶比酶活。

參照單因素實驗的結(jié)果，選取影響內(nèi)源性脂肪酶萃取率的PEG2000、(NH4)2SO4、pH這3個影響因素，各取有意義的3個水平，進行3因素3水平L9(34)正交實驗，以確定最佳的提取條件。見表1所示。

表1 雙水相萃取法的正交實驗因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test by method of aqueous two－phase extraction

1.2.5 雙水相萃取和殼聚糖沉淀相結(jié)合法［12］及其正交實驗設計 此法利用殼聚糖具有多孔結(jié)構(gòu)，能與大分子物質(zhì)固定的特性。由于其分子中的羥基和氨基可形成活潑界面，對蛋白質(zhì)有顯著的親合力，通過離子鍵、氫鍵及范德華力而與載體結(jié)合，從而將酶吸附。

取上述雙水相體系的上相，用濃度為2%的醋酸溶液溶解殼聚糖，加入一定量的殼聚糖醋酸溶液，混合后調(diào)pH至定值，并適當攪拌30min，5000r/min離心20min，棄去上清液，得到殼聚糖－脂肪酶復合物，復合物溶于4mL且pH3.8的醋酸鹽緩沖液中，劇烈攪拌 30min，使殼聚糖－脂肪酶復合物解離，5000r/min離心20min，進一步去除體系中的少量的仍與脂肪酶結(jié)合的殼聚糖和體系中的鹽類及雜質(zhì)，上清液即為脂肪酶溶液。其他同雙水相萃取法。

參照單因素實驗的結(jié)果，選取影響內(nèi)源性脂肪酶萃取率的 PEG2000、(NH4)2SO4、殼聚糖、pH這4個影響因素，各取有意義的3個水平，進行4因素3水平L9(34)正交實驗，以確定最佳的提取條件。見表2所示。

表2 雙水相萃取和殼聚糖沉淀相結(jié)合法的正交實驗因素水平Table 2 Factors and levels of orthogonal test by method of aqueous two－phase extraction and chitosan precipitation

1.2.6 反膠團提取法及其正交實驗設計 十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)是常用的陽離子表面活性劑，在反膠團萃取中，該物質(zhì)既能溶解蛋白質(zhì)又能與水分層，同時不破壞蛋白質(zhì)的生物學活性。此法中的有機溶劑為異辛烷，助溶劑為正己醇。

取相同體積的脂肪酶溶液和CTAB/異辛烷溶液于恒溫反應器中，20℃下磁力攪拌 10min后于3000r/min下離心10min，靜置分層。有機相用于反提取，水相測酶活和蛋白質(zhì)含量，取等體積的反提液和含酶有機相于20℃下磁力攪拌15min，3000r/min下離心5min，靜置分相，測定水相與有機相中酶活性及通過280nm的吸光度來測定總蛋白質(zhì)含量。計算公式:

相比R=水相體積/有機相體積;

分配系數(shù)M=平衡時水相脂肪酶濃度/平衡時有機相脂肪酶濃度;

萃取率C=RM/(1+RM)。

參照單因素實驗的結(jié)果，選取影響內(nèi)源性脂肪酶萃取率的CTAB濃度、相體積比、溫度、pH這4個影響因素，各取有意義的3個水平，進行4因素3水平L9(34)正交實驗，以確定最佳的提取條件。見表3所示。

表3 反膠團提取法的正交實驗因素水平Table 3 Factors and levels of orthogonal test by method of reverse micelles extraction

2 結(jié)果與討論

2.1 雙水相萃取法提取脂肪酶的正交實驗結(jié)果

正交實驗結(jié)果見表4。

表4 雙水相萃取法的正交實驗結(jié)果Table 4 Result of orthogonal experiment by method of aqueous two－phase extraction

根據(jù)表4中極差R值的大小可知，因子的顯著性順序為:PEG2000＞(NH4)2SO4＞pH，根據(jù)均差k值大小可知，各因子的最優(yōu)組合為 A2B2C2，即PEG2000濃度為25%，(NH4)2SO4濃度為12%，pH為6.5，在此最優(yōu)萃取條件下，采用雙水相萃取法萃取豬肉內(nèi)源性脂肪酶的萃取率為94.28%。

2.2 雙水相萃取和殼聚糖沉淀相結(jié)合法萃取脂肪酶的正交實驗結(jié)果

正交實驗結(jié)果見表5。

表5 雙水相萃取和殼聚糖沉淀相結(jié)合法的正交實驗結(jié)果Table 5 Result of orthogonal experiment by aqueous two－phase extraction and chitosan precipitation

根據(jù)表5中極差R值的大小可知，因子的顯著性順序為:PEG2000＞(NH4)2SO4＞pH＞殼聚糖，根據(jù)均差 k值大小可知，各因子的最優(yōu)組合為A2B2D2C2，即 PEG2000 濃度25%，(NH4)2SO4濃度為12%，pH為6.5，殼聚糖濃度為2.5mg/mL，在此條件下采用雙水相萃取和殼聚糖沉淀相結(jié)合法萃取豬肉內(nèi)源性脂肪酶，萃取率為97.83%。

2.3 反膠團法提取脂肪酶的正交實驗結(jié)果

正交實驗結(jié)果見表6。

表6 反膠團提取法的正交實驗結(jié)果Table 6 Result of orthogonal experiment by reverse micelles extraction

根據(jù)表6中極差R值的大小可知，因子的顯著性順序為:CTAB＞pH＞相體積比＞溫度，根據(jù)均差k值大小可知，各因子的最優(yōu)組合為 A2C2B1D3，即CTAB 濃度為150mmol/L，pH 為6.5，相體積比為1∶2，溫度為40℃，在此最優(yōu)萃取條件下，采用反膠團提取法萃取豬肉內(nèi)源性脂肪酶的萃取率為91.71%。

2.4 對三種不同的萃取方法進行分配系數(shù)和純化倍數(shù)的比較

為了比較三種不同方法的萃取效果，按照綜上三組經(jīng)正交實驗分析所得的最佳萃取條件組合，提取豬肉內(nèi)源性脂肪酶，并對提取出的脂肪酶進行分配系數(shù)和純化倍數(shù)的比較，萃取效果見表7所示。

表7 三種方法對豬肉內(nèi)源性脂肪酶的萃取效果Table 7 Three ways on the extraction efficiency of the pork endogenous lipase

由表7可知，采用雙水相萃取和殼聚糖沉淀相結(jié)合的方法提取豬肉內(nèi)源性脂肪酶，萃取效果最顯著，得到的分配系數(shù)和純化倍數(shù)最高，分配系數(shù)為5.208，純化倍數(shù)為7.74倍;采用雙水相萃取法萃取豬肉內(nèi)源性脂肪酶，萃取效果居中，分配系數(shù)為3.902，純化倍數(shù)為3.58倍;采用反膠團提取法提取豬肉內(nèi)源性脂肪酶，萃取效果相對偏低，是由于反膠團提取會造成脂肪酶的比活力有一定程度的降低，使其分配系數(shù)和純化倍數(shù)相對偏低，分配系數(shù)為2.613，純化倍數(shù)為1.57倍。

3 結(jié)論

通過正交實驗對豬肉內(nèi)源性脂肪酶的三種提取方法進行了優(yōu)化分析，結(jié)果表明:采用雙水相萃取和殼聚糖沉淀相結(jié)合法可以使脂肪酶的萃取率、分配系數(shù)和純化倍數(shù)顯著提高，即在PEG2000濃度為25%，(NH4)2SO4濃度為12%，pH6.5，殼聚糖濃度為2.5mg/mL的條件下采用雙水相萃取和殼聚糖沉淀相結(jié)合法，脂肪酶的萃取率為97.83%，分配系數(shù)為5.208，純化倍數(shù)為7.74。本研究為豬肉內(nèi)源性脂肪酶的工業(yè)化利用建立了一條快速、高效率、高活性的提取方法，為工業(yè)規(guī)?；崛≈久傅於死碚摶A。

［1］劉海洲，吳小飛，牛佰慧，等.脂肪酶在食品工業(yè)中的應用與研究進展［J］.糧食加工，2008，33(5):55－57.

［2］Hasan Fariha，Shah Aamer Ali，Hameed Abdul.Industrial applications of microbial lipases［J］.Enzyme and Microbial Technology，2006，39(2):235－251.

［3］黃業(yè)傳.脂肪及脂肪酶在豬肉加工過程中的變化［J］.肉類工業(yè)，2011(2):54－58.

［4］Jin G，Zhang J，Yu X，et al.Lipolys is and lipid oxidat ion in baconduring curing and drying－ ripening［J］.Food Chemistry，2010，123(2):465－471.

［5］Imelio N，Marini A，Spelzini D，et al.Pepsin extraction from bovine stomach using aqueous two－phase systems Molecular mechanism and influence of homogenate mass and phase volume ratio［J］.Journal of Chromatography B，2008，873:133－138.

［6］李凱，李付成，李加友，等.雙水相體系萃取精氨酸脫亞氨酶［J］.精細化工，2008，25(9):865－868.

［7］王俊華，楊潔，付建紅，等.白地霉脂肪酶的雙水相萃取和反膠團提?。跩］.生物技術(shù)通報，2007(1):133－135.

［8］江慧芳，王雅琴，劉春國.三種脂肪酶活力測定方法的比較及改進［J］.化學與生物工程，2007(8):72－75.

［9］Schmidt DC，Sztajer H，Stoeckl ein W，et al.Screening，purification and properties of a thermophilic lipase from Bacillus thermocatenulatus［J］.Biochim Biophys Acta，1994，1214(1):43－53.

［10］余瑞云，袁明秀，陳麗蓉，等.生物化學實驗原理和方法［M］.北京:北京大學出版社，2005:240－242.

［11］王盼盼.雙水相萃取榮昌豬肉脂肪酶及酶學特性研究［D］.重慶:西南大學，2009:16－32.

［12］董娜，董文斌，田穎.雙水相萃取和殼聚糖沉淀相結(jié)合分離豬胃蛋白酶［J］.食品科技，2011，36(1):26－29.

Comparison of three extraction methods for pork endogenous lipase

YAO Xiao－lei，WANG Yu－tian*，MENG Xin
(Food Science and Engineering College，Liaoning Medical University，Jinzhou 121001，China)

The comparison of extraction of pork endogenous lipase with three methods of PEG2000/(NH4)2SO4aqueous two－phase system extraction and reverse micelles extraction and combination of aqueous two－phase extraction and chitosan precipitation in this paper.Further the extraction conditions for each method were optimized by the orthogonal experiment.The optimized condition was gained:mass fraction of PEG2000 25%，mass fraction of(NH4)2SO412%，pH6.5，Chitosan concentration of 2.5mg/mL.Under the condition of aqueous two phaseextraction and chitosan precipitation phase combination，lipase extraction rate was 97.83%，the maximum distribution coefficient 5.209，multiple purification was 7.74.

aqueous two－phase system;reverse micelles;chitosan precipitation;endogenous lipase

TS251.5+1

B

1002－0306(2012)17－0273－04

2012－02－15 *通訊聯(lián)系人

姚曉蕾(1986－)，女，碩士研究生，研究方向:肉制品加工與質(zhì)量控制。

遼寧省科學技術(shù)計劃項目(2010402004)。