徐紅艷，包怡紅 ，楊麗蕓

(1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150040;2.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林延吉 133000)

響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助提取胡桃楸種仁殼總黃酮工藝

徐紅艷1，2，包怡紅1，*，楊麗蕓1

(1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150040;2.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林延吉 133000)

為確定胡桃楸種仁殼總黃酮超聲波輔助提取的最佳工藝條件，以總黃酮得率和總還原力為指標(biāo)，進行單因素實驗，并在此基礎(chǔ)上，選取超聲波功率、超聲波時間、料液比為影響因素，采用響應(yīng)面法進行優(yōu)化并得到回歸模型。結(jié)果表明:最優(yōu)工藝條件為超聲波功率250W，超聲波時間31min，料液比1∶31(g/mL)?；貧w模型預(yù)測的黃酮得率理論值為6.70mg/g，經(jīng)驗證實驗，RSD為1.47%，該回歸方程與實際情況擬合較好。

胡桃楸，種仁殼，總黃酮，響應(yīng)面法，超聲波法

胡桃楸(Juglans mandshurica)又名山核桃、核桃楸、楸樹，為胡桃科胡桃屬落葉喬木。主要分布于遼寧、吉林、黑龍江、河北、山西以及甘肅等地，在東北集中于小興安嶺、完達山脈、長白山區(qū)及遼寧東部，在大興安嶺林區(qū)東南部也有少量分布［1］。胡桃楸種子作為林業(yè)副產(chǎn)品，因其種仁富含蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸，以及多種維生素、氨基酸和鈣、鐵、磷等多種微量元素，早已成為人們的食療佳品［2］，成為研究和關(guān)注的熱點。但在種仁加工過程中，產(chǎn)生大量的種仁殼廢棄物，目前極少部分的種仁殼做燒材或加工成工藝品，而大量的種仁殼則丟棄不用，遠遠沒有實現(xiàn)胡桃楸種子的綜合開發(fā)利用，而對胡桃楸種仁殼活性成份的研究更罕見報道。黃酮類物質(zhì)是在植物中分布非常廣泛的一類天然產(chǎn)物，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗菌、抗病毒等作用［3］;因具有清除自由基的抗氧化活性，使其成為天然抗氧化劑的來源。響應(yīng)曲面法(response surface methodology，RSM)是利用統(tǒng)計軟件進行合理的實驗設(shè)計，通過多元二次回歸方程來擬合變量因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，從而優(yōu)化工藝參數(shù)的統(tǒng)計分析方法。目前已在諸多領(lǐng)域得到應(yīng)用［4－5］。超聲波提取是應(yīng)用超聲波強化提取植物的有效成分，是一種物理破碎過程，對媒質(zhì)主要產(chǎn)生獨特的機械振動作用和空化作用［6］。因其操作簡便快速，提取率高，效果好，并且提取物結(jié)構(gòu)未被破壞，已在生物堿［7］、花色苷［8］、多酚［9］、類黃酮［10］等多種天然產(chǎn)物提取中顯示出明顯的優(yōu)勢。本實驗以胡桃楸種仁殼為原料，采用超聲波輔助方法提取總黃酮，在單因素實驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化其最佳提取工藝，旨在為胡桃楸種仁殼的綜合開發(fā)利用及其活性成份的深入研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

胡桃楸種子 由黑龍江省牡丹江地區(qū)林業(yè)局提供;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 中國藥品生物制品檢定所;亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉 均為分析純。

KQ－500DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;RE－52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠;TU－1810紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 種仁殼總黃酮提取 將胡桃楸種子去仁除雜質(zhì)，粉碎過60目。取2.5g種仁殼粉，加乙醇并密封，室溫浸泡1h后于55℃下超聲波輔助提取，真空抽濾、減壓濃縮并將提取液定容至100mL備用。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制［11］準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品5.0mg，用60%乙醇定容 50mL，配制質(zhì)量濃度為0.10mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。精確移取0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液于 10mL容量瓶中，分別用60%乙醇補至3mL，再分別向各容量瓶中加5% 的 NaNO2溶液 0.4mL，搖勻，靜置 6min;加10%的Al(NO3)3溶液0.4mL，搖勻，靜置6min;最后加入1mol/L的NaOH溶液4mL，定容至刻度，放置20min，在510nm波長處測定其吸光度，以蘆丁質(zhì)量濃度X(mg/mL)為橫坐標(biāo)、以吸光度Y為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為 Y=13.536X－0.0005，相關(guān)系數(shù) R2=0.9994。

1.2.3 提取液總黃酮得率的測定 采用NaNO2－Al(NO3)3比色法［12］，按式(1)計算總黃酮得率:

式中:c為按標(biāo)準(zhǔn)曲線求出的總黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL;n為樣品液測定時的稀釋倍數(shù);v為樣品液的體積，mL;m為取樣品的質(zhì)量，g。

1.2.4 Fe3+總還原力的測定 采用鐵氰化鉀還原法［13］，向試管中加入提取液2mL，再分別加入pH6.6的磷酸緩沖液2.5mL、5%鐵氰化鉀2.5mL，混勻后密封50℃水浴20min，然后冰浴急速冷卻，再加入10%的三氯乙酸2.5mL，混勻并離心10min(4000r/min)。取上清液2.5mL，加入2.5mL蒸餾水，再加入0.5mL三氯化鐵顯色，靜置10min，700nm波長處測定其吸光值A(chǔ)1，以蒸餾水代替提取液為A0，F(xiàn)e3+總還原力=A1－A0，越大說明 Fe3+總還原力越強。

1.2.5 單因素實驗 以超聲波功率、超聲波時間、乙醇濃度、料液比為單因素，以總黃酮得率和Fe3+總還原力為指標(biāo)，進行胡桃楸種仁殼總黃酮提取的單因素實驗。

1.2.6 響應(yīng)面優(yōu)化實驗設(shè)計 根據(jù)Box－Behnken中心組合實驗設(shè)計原理，采用三因素三水平響應(yīng)面分析法。在單因素實驗的基礎(chǔ)上，以60%乙醇為提取劑，選擇超聲波功率、超聲波時間和料液比3個因素為自變量，具體設(shè)計見表1。以總黃酮得率為響應(yīng)值，采用最小二乘法擬合二次多項方程表達響應(yīng)值，實驗設(shè)計與統(tǒng)計分析采用Minitab15軟件。

表1 Box－Behnken實驗因素與水平編碼Table 1 Experimental factors and level coding of Box－Behnken

1.2.7 響應(yīng)面優(yōu)化工藝驗證實驗 按響應(yīng)面優(yōu)化的最佳工藝條件，提取胡桃楸種仁殼總黃酮，進行3次平行實驗，考察響應(yīng)面優(yōu)化工藝條件的重現(xiàn)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 超聲波時間對總黃酮得率和總還原力的影響

稱取2.5g種仁殼粉，按料液比1∶30加入60%乙醇，超聲功率300W，考察超聲波時間對總黃酮得率和總還原力的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 超聲波時間對總黃酮得率和總還原力的影響Fig.1 Effect of time of ultrasonic－assisted extraction on extraction yield of total flavonoids and total reducing power

如圖1所示，隨著超聲波時間的延長，總黃酮得率和總還原力增加，在30min時達到最大，之后超聲波時間延長，但總黃酮得率和總還原力呈下降趨勢，且總還原力下降幅度更大。故選30min為最佳提取時間。

2.1.2 超聲波功率對總黃酮得率和總還原力的影響

稱取2.5g種仁殼粉，按料液比1∶30加入60%乙醇，超聲時間30min，考察超聲波功率對總黃酮得率和總還原力的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 超聲波功率對總黃酮得率和總還原力的影響Fig.2 Effect of power of ultrasonic－assisted extraction on extraction yield of total flavonoids and total reducing power

隨著超聲波功率增大，機械振動作用和空化作用都加強，總黃酮得率和總還原力增加，如圖2所示，當(dāng)超聲波功率在250W時，總黃酮得率和總還原力達最大值，之后隨功率的增加，總黃酮得率和總還原力都下降。故選250W為最佳提取功率。

2.1.3 乙醇濃度對總黃酮得率和總還原力的影響稱取2.5g種仁殼粉，加入不同濃度的乙醇溶液，按料液比1∶30，超聲時間30min，超聲波功率250W，考察乙醇濃度對總黃酮得率和總還原力的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 乙醇濃度對總黃酮得率和總還原力的影響Fig.3 Effect of concentration of ethanol on extraction yield of total flavonoids and total reducing power

如圖3所示，隨著乙醇濃度的增加，總黃酮得率增加，總還原力變化不大;當(dāng)乙醇濃度為40%、50%、60%時，總黃酮得率和總還原力基本相同;之后隨著乙醇濃度的增加，總黃酮得率和總還原力都急劇下降。由于在實際操作中，乙醇濃度越低，真空抽濾越困難，可能是由于糖類等水溶性物質(zhì)過多溶出的緣故，故選60%乙醇為最佳提取劑。

2.1.4 料液比對總黃酮得率和總還原力的影響 稱取2.5g種仁殼粉，按不同料液比加入60%乙醇溶液，超聲波時間30min，超聲波功率250W，考察料液比對總黃酮得率和總還原力的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 料液比對胡桃楸種仁殼總黃酮得率和總還原力的影響Fig.4 Effect of solid/liquid ratio on extraction yield of total flavonoids and total reducing power

如圖4所示，隨著料液比的增大，總黃酮得率和總還原力都呈增加的趨勢，當(dāng)料液比小于1∶30時，增加幅度較大，之后增加緩慢，故選1∶30為最佳提取料液比。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化胡桃楸種仁殼總黃酮提取工藝

根據(jù)表2進行實驗，對實驗結(jié)果回歸擬合所得回歸模型為:

由表3、表4可知，相關(guān)系數(shù)R2=96.49%;響應(yīng)面回歸模型極顯著(p=0.004);模型失擬項不顯著(p=0.722)，說明該二次模型可以較好地描述各因素與響應(yīng)值之間的真實關(guān)系，能夠擬合真實的實驗結(jié)果。

表2 響應(yīng)面實驗設(shè)計方案及結(jié)果Table 2 Design proposal and results of response surface experiment

表3 響應(yīng)面分析優(yōu)化后模型的系數(shù)檢驗Table 3 Coefficient test of optimal mode by response surface methodology

表4 響應(yīng)面優(yōu)化回歸方程的方差分析Table 4 Analysis of variance of optimal regression equation by response surface methodology

圖5～圖7分別為超聲波功率、超聲波時間、料液比三因素影響總黃酮得率的響應(yīng)曲面圖。

綜合分析響應(yīng)面實驗結(jié)果可知，料液比對黃酮得率的影響最大，次之是超聲波時間，超聲波功率影響較小。依據(jù)回歸模型的數(shù)學(xué)分析確定超聲波輔助提取胡桃楸種仁殼黃酮的最佳工藝參數(shù)為:超聲波功率255.7W，超聲波時間31.2min，料液比1∶31.4?；貧w模型預(yù)測的黃酮得率理論值為6.70mg/g。

圖5 Y=f(X1，X2)響應(yīng)曲面圖Fig.5 Respone surface plot for Y=f(X1，X2)

圖6 Y=f(X1，X3)響應(yīng)曲面圖Fig.6 Respone surface plot for Y=f(X1，X3)

圖7 Y=f(X2，X3)響應(yīng)曲面圖Fig.7 Respone surface plot for Y=f(X2，X3)

2.3 響應(yīng)面分析最優(yōu)條件的驗證實驗

響應(yīng)面優(yōu)化的超聲波輔助提取胡桃楸種仁殼黃酮的最佳工藝參數(shù)為:超聲波功率255.7W，超聲波時間31.2min，料液比1∶31.4。綜合實際操作，最終確定最佳工藝參數(shù)為超聲波功率250W，超聲波時間31min，料液比1∶31。以最佳工藝參數(shù)做3次平行實驗，黃酮得率分別為6.63、6.65和6.59mg/g，平均得率為 6.62mg/g，與理論預(yù)測值 6.70mg/g相比，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.47%，可見該模型能較好地模擬和預(yù)測超聲波輔助提取胡桃楸種仁殼黃酮的提取效果。

3 結(jié)論

經(jīng)響應(yīng)面法優(yōu)化的胡桃楸種仁殼黃酮超聲波輔助提取工藝條件為:超聲波功率250W，超聲波時間31min，料液比 1∶31。驗證實驗的黃酮得率為6.62mg/g，與預(yù)測值之間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差較小，證明響應(yīng)面分析法得到的胡桃楸種仁殼黃酮提取條件是真實可靠的。

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Optimization of ultrasonic－assisted extraction of total flavonoids from seed shell of Juglans mandshurica by response surface methodology

XU Hong－yan1，2，BAO Yi－h(huán)ong1，*，YANG Li－yun1
(1.Forestry College of Northeast Forestry University，Harbin 150040，China;2.Agricultural College of Yanbian University，Yanji 133000，China)

To optimize extraction yield of total flavonoids from seed shell of Juglans mandshurica under ultrasonic assistance，single factor test were carried out at extraction yield of total flavonoids and total reducing power as index.Based on this，power of ultrasonic－assisted extraction，time of ultrasonic－assisted extraction and solid－toliquid ratio were selected as variables.And a mathematical model was obtained according to response surface methodology.Results showed that the following optimum parameters:power of ultrasonic－assisted extraction，250W;time of ultrasonic－assisted extraction，31min;and solid－to－liquid ratio，1∶31(g/mL).The predicted value of extraction yield of total flavonoids was 6.70mg/g.After confirmatory test，the relative standard deviation was 1.47%.The regression equation was fitting better with actual situation.

Juglans mandshurica;seed shell;total flavonoids;response surface methodology;ultrasonicassisted extraction

TS255.1

B

1002－0306(2012)17－0248－04

2012－02－23 *通訊聯(lián)系人

徐紅艷(1975－)，女，博士研究生，講師，主要從事天然產(chǎn)物轉(zhuǎn)化與功能性食品研究。

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項(LD09C14)。