車(chē) 馳，李海英，姚新奎，唐血梅，董 婷，孟 軍，祝春梅，曾亞琦，劉婷婷，韓煜茹

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)，新疆烏魯木齊 830052)

新疆酸馬奶中抗氧化益生乳酸菌的篩選

車(chē) 馳，李海英，姚新奎*，唐血梅，董 婷，孟 軍，祝春梅，曾亞琦，劉婷婷，韓煜茹

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)，新疆烏魯木齊 830052)

目的:篩選出性狀優(yōu)良、具有抗氧化活性的乳酸菌菌株，為開(kāi)發(fā)具有抗氧化活性的功能性食品提供理論依據(jù)。方法:通過(guò)菌株對(duì)H2O2的耐受能力實(shí)驗(yàn)、羥自由基清除實(shí)驗(yàn)、還原活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)以及亞鐵離子螯合能力測(cè)定實(shí)驗(yàn)，對(duì)28株乳酸菌活細(xì)胞體、無(wú)細(xì)胞提取物以及胞外分泌物的抗氧化能力進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果:兩株益生乳酸菌S3、Y11具有較高的抗氧化能力，對(duì)實(shí)驗(yàn)所用的不同濃度過(guò)氧化氫具有一定的耐受能力;當(dāng)添加樣品量為1.5mL時(shí)，兩株菌的活細(xì)胞體和無(wú)細(xì)胞提取物對(duì)羥自由基的清除率分別為38.1%和25.2%，52.3%和29.7%;兩株菌均具有還原活性，A700nm值分別為2.272和3.083;兩株菌對(duì)亞鐵離子(Fe2+)的螯合率分別為36.62%和43.16%。結(jié)論:28株乳酸菌菌株的抗氧化能力存在差異，乳酸菌菌體內(nèi)可能含有較多的起抗氧化作用的活性物質(zhì)，并篩選出2株具有較強(qiáng)抗氧化能力的乳酸菌菌株。

抗氧化，益生乳酸菌，篩選，還原能力

氧化作用是有機(jī)體的必要代謝過(guò)程，但是過(guò)度的氧化作用會(huì)造成生物大分子的損傷［1］。氧化代謝過(guò)程中不斷產(chǎn)生各種活性氧分子(ROS)，如羥自由基(·OH)、超氧陰離子自由基(·)、烷氧自由基(RO·)、過(guò)氧化氫(H2O2)等，可對(duì) DNA、脂質(zhì)及蛋白質(zhì)造成損傷，并引發(fā)諸如癌癥、動(dòng)脈硬化、糖尿病、心血管病等多種疾?。?－4］。乳酸菌具有多種生理功能［5］，如緩解腹瀉，調(diào)節(jié)腸道菌群平衡;降低血脂膽固醇水平;調(diào)節(jié)血壓作用;提高免疫功能［6－9］等。研究表明:某些乳酸菌具有顯著的抗氧化活性，孟和畢力格等報(bào)道了酸馬奶中的嗜酸乳桿菌MG2－1菌株具有抗氧化活性［10］。在檢測(cè)乳酸菌的抗氧化活性時(shí)，目前主要測(cè)定菌株耐受H2O2的能力、清除超氧陰離子自由基(·)的能力、清除羥自由基(·OH)的能力、螯合Fe2+的能力、抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力、清除二苯代苦味肼基自由基(DPPH·)的能力及還原活性。本研究通過(guò)菌株對(duì)H2O2的耐受能力實(shí)驗(yàn)、羥自由基清除實(shí)驗(yàn)、還原活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)以及亞鐵離子螯合能力測(cè)定實(shí)驗(yàn)，對(duì)新疆少數(shù)民族地區(qū)傳統(tǒng)自制酸馬奶中的28株乳酸菌的活細(xì)胞體、無(wú)細(xì)胞提取物以及胞外分泌物的抗氧化能力進(jìn)行測(cè)定，從中篩選出具有較好抗氧化活性的益生乳酸菌。為將具有抗氧化活性的乳酸菌應(yīng)用于功能性食品的開(kāi)發(fā)和生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

28株乳酸菌菌株 編號(hào)S1～S14，樣品采于新疆烏魯木齊水西溝牧民家庭自制酸馬奶;Y1～Y14 樣品采于伊犁地區(qū)牧民家庭自制酸馬奶，由實(shí)驗(yàn)室分離、保存;MRS培養(yǎng)基 蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母提取物5g，葡萄糖20g，乙酸鈉5g，檸檬酸氫二氨2g，KH2PO42g，吐溫 80 1mL，MnSO4·4H2O 0.25g，MgSO4·7H2O 0.58g，瓊脂 15g，溴甲酚綠 0.03g，加水定容至 1000mL，pH6.2～6.4，滅菌，接入樣品前加入0.4mmol/L H2O2;PBS 緩沖液 NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4·7H2O 1.14g，KH2PO40.24g，加水定容至1000mL，pH7.4;鐵氰化鉀、L﹣半胱氨酸鹽酸鹽、過(guò)氧化氫、FeSO4、鄰－菲羅啉、三氯乙酸、三氯化鐵、抗壞血酸等試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

TGL－16M高速臺(tái)式冷凍離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司;TU－1810紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;立式壓力蒸汽滅菌器、數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;超聲波細(xì)胞粉碎儀 JY96－IIN;酸度計(jì)美國(guó)梅特勒－托利多儀器有限公司;恒溫水浴振蕩器 北京桑翌實(shí)驗(yàn)儀器研究所。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 乳酸菌的培養(yǎng)及菌體、胞外分泌物、無(wú)細(xì)胞提取物的制備 供試菌于MRS培養(yǎng)基37℃靜置培養(yǎng)24h后，發(fā)酵液5000r/min離心15min，收集菌體，并用雙蒸水洗滌3次，最后用雙蒸水將乳酸菌的菌數(shù)調(diào)整到1010cfu/mL，即為待測(cè)菌體(IC)。

供試菌于MRS培養(yǎng)基37℃靜置培養(yǎng)24h后，收集發(fā)酵液，用雙蒸水將乳酸菌的菌數(shù)調(diào)整到1010cfu/mL，在5000r/min轉(zhuǎn)速下離心15min，收集上清液，即為胞外分泌物。

供試菌于MRS培養(yǎng)基37℃靜置培養(yǎng)24h后，發(fā)酵液5000r/min離心15min，收集菌體，用PBS洗滌3次，重懸于PBS，調(diào)整菌數(shù)到1010cfu/mL，冰浴超聲破碎細(xì)胞，4℃ 12000×g離心30min，收集上清液，即為無(wú)細(xì)胞提取物(CFE)［11］。

1.2.2 乳酸菌在不同濃度H2O2溶液中的耐受能力測(cè)定 在100mL滅過(guò)菌的三角瓶中加入60mL MRS培養(yǎng)基，分別添加過(guò)氧化氫溶液，使培養(yǎng)基中的起始H2O2濃度分別為0.4、0.7、1.0mmol/L，并按體積分?jǐn)?shù)1%的接種量接入分離所得的菌株培養(yǎng)液，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，取樣測(cè)定OD600值，觀察每株菌在不同起始過(guò)氧化氫濃度下的生長(zhǎng)趨勢(shì)，篩選具有高過(guò)氧化氫耐受性的乳酸菌［12］。

1.2.3 乳酸菌清除羥自由基(·OH)能力的測(cè)定在10mL具塞試管中依次加入5mmol/L硫酸亞鐵溶液1mL，5mmol/L水楊酸－乙醇溶液1mL，3mmol/L雙氧水溶液1mL，混合均勻后加入不同體積(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL)的待測(cè)液，與待測(cè)液相同體積的1mmol/L的抗壞血酸做陽(yáng)性對(duì)照，用雙蒸水補(bǔ)齊至刻度，在(37±0.1)℃的恒溫水中反應(yīng)15min后，6000r/min離心 10min，然后以雙蒸水做參比，在510nm下測(cè)定吸光度［13］。計(jì)算清除率:

其中A0為對(duì)照液的吸光度，Ax為加入待測(cè)液后的吸光度，每一吸光值平行測(cè)三次，取其平均值。

1.2.4 乳酸菌還原活性的測(cè)定 反應(yīng)液中乳酸菌待測(cè)液0.5mL，1%鐵氰化鉀0.5mL，磷酸鹽緩沖液(PBS 0.2mol/L，pH6.6)0.5mL，混合后在 50℃ 水浴中反應(yīng)20min，冷卻并加入10%三氯乙酸0.5mL，沉淀蛋白，離心后取1mL上清液與1mL 0.1%三氯化鐵反應(yīng)，于700nm測(cè)吸光值，其中L－半胱氨酸鹽酸鹽(1%)作為標(biāo)品［14］。

1.2.5 乳酸菌與亞鐵離子(Fe2+)螯合能力的測(cè)定1% 抗 壞 血 酸 0.1mL，0.4% FeSO40.1mL，NaOH(0.2mol/L)1mL的混合液加入0.5mL的乳酸菌的待測(cè)液，混合液37℃水浴20min，三氯乙酸沉淀蛋白，3000×g、4℃離心10mim，取0.2mL上清液加入2mL 0.1%鄰－菲羅啉反應(yīng)10min，于510nm測(cè)吸光值，以磷酸鹽緩沖液(PBS 0.2mol/L，pH6.6)作為空白對(duì)照［15］。

2 結(jié)果與討論

2.1 乳酸菌在不同濃度過(guò)氧化氫溶液中的耐受能力

過(guò)氧化氫是一種強(qiáng)氧化劑，可以對(duì)細(xì)胞和組織造成直接破壞，或作為羥自由基(·OH)前體間接參與氧化過(guò)程。

將乳酸菌菌株分別接種于含有不同濃度的過(guò)氧化氫培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h，檢測(cè)其菌體濃度(OD600值表示)，結(jié)果見(jiàn)表1～表2。

從表1～表2可以看出，S3、Y6、Y11三株乳酸菌在過(guò)氧化氫濃度分別為0.4、0.7、1.0mmol/L的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)所測(cè)得的OD600值與空白溶液中的OD600沒(méi)有太大的變化，表明這三株乳酸菌在實(shí)驗(yàn)所用的過(guò)氧化氫濃度下其生長(zhǎng)幾乎不受影響，說(shuō)明這三株乳酸菌對(duì)過(guò)氧化氫有一定的耐受能力。

2.2 乳酸菌對(duì)羥自由基(·OH)的清除能力

本實(shí)驗(yàn)對(duì)S3、Y6、Y11三株菌的菌體及無(wú)細(xì)胞提取物進(jìn)行了羥自由基清除能力的研究，以對(duì)羥自由基具有較強(qiáng)清除能力的抗壞血酸做陽(yáng)性對(duì)照，結(jié)果見(jiàn)圖1～圖3。

圖1 乳酸菌S3菌體及無(wú)細(xì)胞提取物清除羥自由基能力Fig.1 ·OH－scavenging capabilities by live cells and cell－free extracts of strain S3

從圖1～圖3可以看出，三株乳酸菌S3、Y6、Y11的活細(xì)胞體及無(wú)細(xì)胞提取物均表現(xiàn)出一定的清除羥自由基的能力，當(dāng)添加樣品量為1.5mL時(shí)，乳酸菌S3的活細(xì)胞體及無(wú)細(xì)胞提取物對(duì)羥自由基的清除率分別為38.1%和25.2%;乳酸菌Y6的活細(xì)胞體及無(wú)細(xì)胞提取物對(duì)羥自由基的清除率分別為50.3%和30.6%;乳酸菌Y11的活細(xì)胞體及無(wú)細(xì)胞提取物對(duì)羥自由基的清除率分別為52.3%和29.7%，而添加相同體積的1mmol/L的抗壞血酸，其對(duì)羥自由基的清除率為22.8%。另外，乳酸菌對(duì)羥自由基的清除能力與乳酸菌的添加量呈現(xiàn)正比關(guān)系。

2.3 乳酸菌的還原活性

一般情況下，樣品的還原力與抗氧化能力呈正相關(guān)，于700nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度，吸光度越大，表明樣品的還原能力越強(qiáng)。結(jié)果見(jiàn)表3～表4。

從表3～表4可以看出，28株乳酸菌均表現(xiàn)出一定的還原能力，其中菌株 S3、S8、S11、Y5、Y6、Y10、Y11、Y12的還原能力比標(biāo)品的還原能力強(qiáng)，其中菌株Y11的還原能力最強(qiáng)，A700nm為3.083;菌株S1的還原能力最弱，A700nm為0.043。實(shí)驗(yàn)表明:乳酸菌具有還原能力的活性物質(zhì)的含量在不同菌株間具有差異。

表1 含有不同濃度H2O2培養(yǎng)基中乳酸菌的菌體濃度Table 1 Density of lactobacillus in media with various H2O2concentrations

表2 含有不同濃度H2O2培養(yǎng)基中乳酸菌的菌體濃度Table 2 Density of lactobacillus in media with various H2O2concentrations

表3 乳酸菌菌株胞外分泌物的還原能力Table 3 Reducing activity of extracellular secretion from lactobacillus

表4 乳酸菌菌株胞外分泌物的還原能力Table 4 Reducing activity of extracellular secretion from lactobacillus

表5 乳酸菌體與亞鐵離子(Fe2+)的螯合能力Table 5 Ferrous ion chelating abilities of lactobacillus

表6 乳酸菌體與亞鐵離子(Fe2+)的螯合能力Table 6 Ferrous ion chelating abilities of lactobacillus

圖2 乳酸菌Y6菌體及無(wú)細(xì)胞提取物清除羥自由基能力Fig.2 ·OH－scavenging capabilities by live cells and cell－free extracts of strain Y6

2.4 乳酸菌與亞鐵離子(Fe2+)的螯合能力

圖3 乳酸菌Y11菌體及無(wú)細(xì)胞提取物清除羥自由基能力Fig.3 ·OH－scavenging capabilities by live cells and cell－free extracts of strain Y11

有些蛋白質(zhì)常會(huì)結(jié)合亞鐵離子(Fe2+)，在特定位置上形成羥基，促進(jìn)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的進(jìn)行，引起生物大分子的損傷。各菌株對(duì)亞鐵離子(Fe2+)的螯合能力結(jié)果見(jiàn)表5～表6。

從表5～表6可以看出，28株乳酸菌菌體對(duì)亞鐵離子(Fe2+)均有一定的螯合能力，其無(wú)細(xì)胞提取物對(duì)亞鐵離子(Fe2+)的螯合能力較弱。乳酸菌S3、Y5、Y10、Y11對(duì)亞鐵離子(Fe2+)的螯合率分別為36.62%、38.71%、31.03%、43.16%，高于其余菌株。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:乳酸菌菌體組成成分中可能含有較多的螯合亞鐵離子(Fe2+)的活性物質(zhì)。

3 結(jié)論

本研究以具有抗氧化活性為篩選指標(biāo)，對(duì)28株乳酸菌的活細(xì)胞體、無(wú)細(xì)胞提取物以及胞外分泌物的抗氧化能力進(jìn)行測(cè)定，從中篩選出兩株益生乳酸菌S3、Y11，兩株菌在過(guò)氧化氫溶液中具有較好的耐受性，具有較高的清除羥自由基的能力和螯合亞鐵離子(Fe2+)的能力，具有高效的還原活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:乳酸菌菌體內(nèi)可能含有較多的起抗氧化作用的活性物質(zhì)，下一步應(yīng)分離出這種起抗氧化作用的活性物質(zhì)，并對(duì)其進(jìn)行深入研究，為將具有抗氧化活性乳酸菌應(yīng)用于功能性食品的開(kāi)發(fā)和生產(chǎn)提供充分的理論依據(jù)。

［1］李素云，王立芹，鄭嫁琳，等.自由基與衰老的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)老年學(xué)雜志，2007，27(20):2046－2048.

［2］張江巍，曹郁生，李海星，等.乳酸菌抗氧化活性及檢測(cè)方法 .［J］.中國(guó)乳品工業(yè)，2005，33(9):53－56.

［3］張江巍，曹郁生.乳酸菌抗氧化活性的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)乳品工業(yè)，2005，33(1):34－36.

［4］李勇，孔令青，高洪，等.自由基與疾病研究進(jìn)展［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2008，29(4):85－88.

［5］王嬌.乳酸菌生理功能的研究進(jìn)展［J］.四川食品與發(fā)酵，2005，41(2):43－46.

［6］Gotz V，Romankiewicz JA，Moss J.Prophylaxis against ampicillin－associated diarrhea with a lactobacillus preparation［J］.American Journal of Hospital Pharmacy，1979(36):754－757.

［7］Gilliland S E，Speck M L.Deconjugation of bile－acids by intestinal lactobacilli［J］ .Applied and Environmental Microbiology，1977(33):15－18.

［8］Akalin A S，Gonc S，Duzel S.Influence of yogurt and acidophilus yogurt on serum cholesterol levels in mice［J］.Journal of Dairy Science，1997(11):2721－2725.

［9］ Perdigon G，Locascio M，MediciM.Interaction of bifidobacteria with the gut and their influence in the immune function［J］.Biocell，2003(1):1－9.

［10］孟和畢力格，周雨霞，張和平，等.酸馬奶中乳桿菌MG2－1株的抗氧化作用研究［J］.中國(guó)乳品工業(yè)，2005，33(9):21－24.

［11］Wang Y C，Yor C，Chou C C.Antioxidative activities of soymilks fermented with lactic acid bacteria and bifidobacteria［J］.Food Microbiology，2006(23):128－135.

［12］Van Niel E W，Hofvendahl K，Hahn－Hagerdal B.Formation and conversion of oxygen metabolites by Lactococcus lactis subsp.Lactis ATCC 19435 under Different Growth Conditions［J］.Appl Environ Microbiol，2002(68):4350－4356.

［13］李志英，張海容，梁會(huì)艷.5種葡萄酒清除羥自由基的比較［J］.釀酒科技，2006，142(4):26－29.

［14］Winklhofer Roob B M，Ellemunter H，F(xiàn)ruhwirth M，et al.Plasma vitamin C concentrations in patients with cystic fibrosis:evidence of associations with lung inflammation［J］.Am EricanJo Urnalof Clinical Nutrition，1997，65(6):1858－1866.

［15］Amanatidou A，Smid E J，Bennik M H J，et al.Antioxidative properties of lactobacillus sake upon exposure to elevated oxygen concentrations［J］.FEMS Microbiology Letters，2001，203(1):87－94.

Screening of antioxidative lactobacillus from Koumiss in Xinjiang

CHE Chi，LI Hai－ying，YAO Xin－kui*，TANG Xue－mei，DONG Ting，MENG Jun，ZHU Chun－mei，ZENG Ya－qi，LIU Ting－ting，HAN Yu－ru
(Xinjiang Agricultural University，Urmuqi 830052，China)

Objective:In order to provide theoretical evidences for developing functional food with antioxidative activity，lactobacillus strains with antioxidative activity were selected.Methods:The antioxidant capabilities of 28 lactobacillus strains of live cells，cell－ free extracts and extracellular secretions were determined through H2O2tolerance capability，scavenging capabilities of hydroxyl free radical，reducing activities and chelation abilities of ferrous ion.Results:S3 and Y11 displayed the excellent antioxidant capabilities among 28 lactobacillus strains.The two desired strains showed excellent tolerance in different concentration of H2O2in culture media;Scavenging efficiencies of S3 and Y11 cell suspension and cell－free extracts were 38.1%，25.2%and 52.3%，29.7%for hydroxyl free radicals when addition level was 1.5mL;The two lactobacillus strains showed good reducing activities，the values of A700nmwere 2.272 and 3.083;The percentage of chelating ferrous ion(Fe2+)capacity were 36.62%and 43.16%，respectively.Conclusion:28 lactobacillus strains had different antioxidant capabilities.Antioxidative active substances might exist in lactobacillus live cells，and 2 lactobacillus strains with antioxidative activity were selected.

antioxidative activity;lactobacillus;screening;reducing activity

TS252.1

A

1002－0306(2012)17－0176－04

2011－10－24 *通訊聯(lián)系人

車(chē)馳(1985－)，女，在讀碩士研究生，研究方向:乳及乳制品質(zhì)量安全控制技術(shù)。

國(guó)家農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)專(zhuān)項(xiàng)(201003075);新疆維吾爾自治區(qū)科技重大專(zhuān)項(xiàng)(201130101)。