朱旭亞，陸 健，謝廣發(fā)

(1.江南大學(xué)糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫 214122;2.江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫 214122;3.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇無錫 214122;4.浙江古越龍山紹興酒股份有限公司，浙江紹興 312000)

脲基酰胺酶基因在黃酒酵母中的整合型表達(dá)

朱旭亞1，2，3，陸 健1，2，3，謝廣發(fā)3，4，*

(1.江南大學(xué)糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫 214122;2.江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫 214122;3.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇無錫 214122;4.浙江古越龍山紹興酒股份有限公司，浙江紹興 312000)

氨基甲酸乙酯是一種人類的潛在致癌物，在許多發(fā)酵酒中均有存在，主要來源于發(fā)酵過程中酵母代謝產(chǎn)生的尿素。以pYX212為載體，將脲基酰胺酶基因DUR1，2克隆到TPI強(qiáng)啟動(dòng)子和終止子之間的位點(diǎn)，再通過同源重組的方式將受強(qiáng)啟動(dòng)子調(diào)控的目的基因整合到黃酒酵母的基因組中，最終獲得一株低產(chǎn)尿素的胞內(nèi)脲基酰胺酶基因組成型高表達(dá)的黃酒酵母85#DUR1，2。在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的黃酒釀造實(shí)驗(yàn)中，85#DUR1，2產(chǎn)尿素量為8.34mg/L，比出發(fā)菌株降低了69.9%，貯存一段時(shí)間后的酒液中氨基甲酸乙酯含量比出發(fā)菌株降低了40.5%，而發(fā)酵性能、酒精度、總酸及氨基態(tài)氮與出發(fā)菌株無顯著差異。

氨基甲酸乙酯，尿素，黃酒，脲基酰胺酶基因，酵母

氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate，簡(jiǎn)稱EC)是一種人類潛在的致癌物，在發(fā)酵食品和酒精飲料中廣泛存在［1］。目前，EC的檢測(cè)主要用的是 GC/MS法，通過此法檢測(cè)表明，在白蘭地、威士忌、中國黃酒、日本清酒和葡萄酒中，EC 含量較高［1－2］。因此，許多國家已針對(duì)葡萄酒、清酒、白蘭地、威士忌等酒種制定了相應(yīng)的EC限量標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)黃酒中EC含量的控制已迫在眉睫［3－4］。黃酒中90%的氨基甲酸乙酯由尿素和乙醇反應(yīng)生成，而尿素主要是在發(fā)酵過程中由酵母代謝產(chǎn)生［5］。酵母通過精氨酸酶(CAR1基因編碼)分解精氨酸產(chǎn)生尿素，再通過脲基酰胺酶(DUR1，2基因編碼)將尿素分解成氨和二氧化碳。研究表明，釀酒酵母在生長(zhǎng)繁殖和進(jìn)行酒精發(fā)酵時(shí)存在氮源代謝阻遏(nitrogen catabolite repression，簡(jiǎn)稱 NCR)機(jī)制，即酵母會(huì)優(yōu)先利用氨，當(dāng)氨利用完全后才利用尿素作為氮源［6］。因此，在酒精發(fā)酵階段，精氨酸大量水解成尿素，DUR1，2基因由于受到NCR作用，表達(dá)水平遠(yuǎn)低于CAR1，多余尿素不能被及時(shí)分解，隨即被轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞，使發(fā)酵液中的尿素含量大幅增加［7－9］，最終導(dǎo)致黃酒中形成較高量的EC。使用低產(chǎn)尿素的黃酒酵母可以有效地解決黃酒中EC含量過高的問題。目前，國外已有對(duì)葡萄酒酵母和清酒酵母進(jìn)行低產(chǎn)尿素功能改造的相關(guān)報(bào)道，其中通過組成型高表達(dá)脲基酰胺酶基因進(jìn)行酵母工程菌的構(gòu)建被認(rèn)為是最優(yōu)策略。通過這種手段構(gòu)建的葡萄酒酵母 522DUR1，2獲 得 美 國 FDA 的 GRAS(Generally Regarded As Safe)認(rèn)證，實(shí)現(xiàn)了商業(yè)化［10］。本研究以黃酒生產(chǎn)常用的酵母菌株85#為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，將其脲基酰胺酶基因DUR1，2進(jìn)行克隆，并通過同源重組整合到基因組中，考察獲得的代謝工程菌低產(chǎn)尿素效果，以期為解決黃酒EC含量偏高問題提供一種有效的參考思路和方法。

表1 實(shí)驗(yàn)用的主要引物Table 1 Primers used in the experiment

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

大腸桿菌E.coli JM109 實(shí)驗(yàn)室保存;黃酒酵母85# 浙江古越龍山紹興酒股份有限公司;質(zhì)粒pPICZα 實(shí)驗(yàn)室保存;質(zhì)粒pYX212 由江南大學(xué)生物工程學(xué)院周景文博士提供;LB培養(yǎng)基 0.5%酵母粉、1%蛋白胨、1%氯化鈉，使用前加入氨芐青霉素(工作濃度為50μg/mL)或博來霉素(即Zeocin抗生素，工作濃度為50μg/mL)，固體培養(yǎng)基在液體培養(yǎng)基中加入2%瓊脂;YPD培養(yǎng)基 1%酵母粉、2%蛋白胨、2%葡萄糖，使用前加入Zeocin抗生素(工作濃度為300μg/mL)，固體培養(yǎng)基在液體培養(yǎng)基中加入2%瓊脂;尿素培養(yǎng)基 0.17%YNB(酵母無氨基氮源)、2%葡萄糖、0.1%尿素;限制性內(nèi)切酶、Taq DNA聚合酶、Prime Star DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、DNA膠回收試劑盒等 Takara公司;質(zhì)粒小量提取試劑盒 上海生工公司;酵母基因組提取試劑盒 北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 PCR引物的設(shè)計(jì) 根據(jù)已知的DUR1，2基因、Sh ble基因及pYX212質(zhì)粒的序列，設(shè)計(jì)相應(yīng)的PCR引物進(jìn)行基因的擴(kuò)增或重組子的鑒定，列于表1，引物由上海賽百盛公司合成。

1.2.2 表達(dá)載體pYX212－DUR1，2的構(gòu)建 參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版)》［11］，進(jìn)行相關(guān)的分子操作，構(gòu)建含有脲基酰胺酶基因編碼框的重組表達(dá)質(zhì)粒pYX212－DUR1，2。構(gòu)建的質(zhì)粒送Takara公司測(cè)序鑒定。

1.2.3 共轉(zhuǎn)質(zhì)粒pYX212－Sh ble的構(gòu)建 參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版)》［11］，構(gòu)建含抗生素標(biāo)記的選擇載體 pYX212－Sh ble。

1.2.4 黃酒酵母的轉(zhuǎn)化 參照文獻(xiàn)［12］，采用醋酸鋰法，將表達(dá)載體pYX212－DUR1，2線性化后與質(zhì)粒pYX212－Sh ble共轉(zhuǎn)化黃酒酵母85#。

1.2.5 酵母陽性轉(zhuǎn)化子的篩選、鑒定 隨機(jī)挑取平板上的轉(zhuǎn)化子，先用引物P5/P6進(jìn)行PCR鑒定，以確定目的基因是否進(jìn)入酵母細(xì)胞。對(duì)于陽性結(jié)果的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行劃線轉(zhuǎn)接，再用試劑盒提取其基因組，以此為模板，P5/P2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，二次鑒定，驗(yàn)證目的基因整合位點(diǎn)是否正確。

1.2.6 尿素消耗實(shí)驗(yàn) 將經(jīng)PCR鑒定獲得的陽性轉(zhuǎn)化子和初始菌株分別接種于YPD液體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)20h，分別取等量培養(yǎng)液以1∶100的比例轉(zhuǎn)接到尿素培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)。24h后分別取1mL培養(yǎng)液，測(cè)定其中尿素的含量。此實(shí)驗(yàn)可快速檢測(cè)酵母轉(zhuǎn)化菌株分解尿素的能力，以對(duì)酵母陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)一步鑒定，驗(yàn)證其低產(chǎn)尿素效果。

1.2.7 黃酒發(fā)酵實(shí)驗(yàn) 分別采用獲得的改造菌株與初始菌株進(jìn)行黃酒的小試發(fā)酵，方法為:稱取100g大米，浸米、蒸飯，攤飯冷卻，加麥曲和水拌飯，添加量為:麥曲15g、水170g，然后再加適量糖化酶，按照10%接種量接入黃酒酵母，30℃主酵4d，15℃后酵15d，每個(gè)菌株做三次重復(fù)。對(duì)于發(fā)酵獲得的酒液，煎酒過濾后于4℃貯存，并進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定?？偺?、總酸、酒精度、氨基態(tài)氮按照黃酒國標(biāo)(GB/T 13662－2008)進(jìn)行測(cè)定，尿素參照相關(guān)文獻(xiàn)［13］，采用比色法進(jìn)行測(cè)定，EC 采用 GC－MS 測(cè)定［14］。

1.2.8 遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 將獲得的黃酒酵母工程菌進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，連續(xù)傳代發(fā)酵5次，考察其低產(chǎn)尿素遺傳性狀的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 表達(dá)載體pYX212－DUR1，2的篩選及鑒定

從含有氨芐青霉素的LB平板上挑取大腸桿菌轉(zhuǎn)化子，以其為模板，以P1/P2為引物進(jìn)行快速菌落PCR鑒定，再以鑒定陽性的單菌落進(jìn)行質(zhì)粒抽提，酶切驗(yàn)證。結(jié)果如圖1，用EcoRⅠ/BamHⅠ雙酶切重組質(zhì)粒后，得到了兩個(gè)片段，分別約5.5kb和8.3kb，大小與目的基因及空載體酶切后大小一致，證明目的基因片段插入正確。測(cè)序結(jié)果與GeneBank中報(bào)道的序列進(jìn)行比對(duì)，DUR1，2基因編碼框內(nèi)第532位堿基由T變?yōu)镃，但編碼的氨基酸序列不變，因此符合要求。將獲得的重組質(zhì)粒命名為pYX212－DUR1，2。

2.2 共轉(zhuǎn)質(zhì)粒pYX212－Sh ble的篩選及鑒定

圖1 重組質(zhì)粒pYX212－DUR1，2的EcoRⅠ/BamHⅠ雙酶切驗(yàn)證Fig.1 The restriction analysis of plasmid pYX212－DUR1，2 by EcoRⅠ/BamHⅠ

從含有氨芐青霉素的LB平板上挑取大腸桿菌轉(zhuǎn)化子，以其為模板，以P3/P4為引物進(jìn)行快速菌落PCR鑒定，再用陽性轉(zhuǎn)化子的單菌落，提質(zhì)粒酶切驗(yàn)證。如圖2，EcoRⅠ/HindⅢ雙酶切重組質(zhì)粒后獲得了約0.4kb和8.3kb的兩個(gè)片段，與Sh ble基因和pYX212質(zhì)粒雙酶切后的片段大小相符，證明Sh ble基因已正確插入質(zhì)粒pYX212內(nèi)部。

圖2 重組質(zhì)粒pYX212－Sh ble的EcoRⅠ/HindⅢ雙酶切驗(yàn)證Fig.2 The restriction analysis of plasmid pYX212－sh ble by EcoRⅠ/HindⅢ

2.3 酵母轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子的篩選、鑒定

將重組質(zhì)粒 pYX212－DUR1，2用 BglⅡ線性化后，與共轉(zhuǎn)質(zhì)粒pYX212－Sh ble共轉(zhuǎn)黃酒酵母85#，使目的基因通過同源重組整合到酵母的基因組中，如圖3。

圖3 重組黃酒酵母85#DUR1，2的構(gòu)建Fig.3 Construction of recombinant yeast 85#DUR1，2

在含Zeocin抗生素的YPD平板上挑取酵母轉(zhuǎn)化子，以P5/P6為引物進(jìn)行快速菌落PCR鑒定，發(fā)現(xiàn)較多轉(zhuǎn)化子能擴(kuò)增出771bp的目標(biāo)條帶，初步斷定目的基因轉(zhuǎn)入酵母胞內(nèi)(見圖4A)。以這些酵母轉(zhuǎn)化子的基因組作為模板，以P5/P2為引物進(jìn)行二次PCR驗(yàn)證，獲得1株轉(zhuǎn)化子可擴(kuò)增出目標(biāo)條帶(TPI啟動(dòng)子－DUR1，2編碼框區(qū)域)，將這株酵母轉(zhuǎn)化子命名為 85#DUR1，2(見圖 4B)。

圖4 酵母轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定Fig.4 PCR identification of yeast transformants

2.4 尿素消耗實(shí)驗(yàn)結(jié)果

將 85#、85#DUR1，2同時(shí)進(jìn)行尿素消耗實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步驗(yàn)證二次PCR鑒定獲得的菌株是否符合要求，結(jié)果發(fā)現(xiàn)85#DUR1，2菌株分解尿素的能力明顯高于85#菌株(見圖5)，證明其脲基酰胺酶基因得到高表達(dá)。

圖5 工程菌株與出發(fā)菌株24h尿素消耗對(duì)比Fig.5 The comparison of urea degradation in 24 hours between the engineering and parental strains

2.5 黃酒發(fā)酵結(jié)果

對(duì)發(fā)酵后的黃酒進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定，結(jié)果如表2。從表2可以看出，與出發(fā)菌株相比，改造菌株釀造的黃酒在總糖、酒精度、總酸和氨基態(tài)氮方面沒有明顯的差異，而尿素和EC含量卻顯著降低，分別比出發(fā)菌株降低了69.9%和40.5%，說明改造菌株在不改變出發(fā)菌株發(fā)酵性能的前提下，能顯著降低其產(chǎn)尿素的能力，對(duì)降低黃酒中EC的含量具有較好的效果。

2.6 遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

對(duì)獲得的黃酒酵母工程菌85#DUR1，2進(jìn)行了連續(xù)5次的傳代發(fā)酵，測(cè)定每代酵母產(chǎn)尿素情況，發(fā)現(xiàn)5代酵母工程菌株與0代酵母工程菌株的產(chǎn)尿素含量均在8.21～9.08mg/L之間，無明顯變化，證明該菌株有較好的遺傳穩(wěn)定性。

3 結(jié)論

本研究通過組成型高表達(dá)脲基酰胺酶基因，構(gòu)建了一株低產(chǎn)尿素且遺傳穩(wěn)定的黃酒酵母代謝工程菌。與出發(fā)菌株相比，其尿素產(chǎn)量降低了69.9%，釀造的酒液貯存一段時(shí)間后，EC含量降低了40.5%，而其他發(fā)酵指標(biāo)基本不變。

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Constitutive expression of DUR1，2 gene in Chinese rice wine yeast

ZHU Xu－ya1，2，3，LU Jian1，2，3，XIE Guang－fa3，4，*
(1.National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China;2.The Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China;3.School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China;4.Zhejiang Guyue Longshan Shaoxing Wine Co.，Ltd.Shaoxing 312000，China)

Ethyl carbamate(EC)is a potential carcinogen for human，which can be found in many fermented alcoholic beverages.The main precursor for EC is urea produced by yeast.The DUR1，2 gene which encoded urea amidolyase was cloned into plasmid pYX212 between the TPI promoter and terminator sites to form the DUR1，2 expression cassette.The cassette was then integrated into the genome of the Chinese rice wine yeast 85#.Thus a urea－ degrading Chinese rice wine yeast 85#DUR1，2was obtained.According to the laboratory scale rice wine brewing tests，urea was reduced to 8.34mg/L by yeast 85#DUR1，2，69.9%less than the parental strain，while the ethyl carbamate level was 40.5%less than that of the parental strain after a period of storage.Meanwhile，85#DUR1，2was substantially equivalent to its parental strain in terms of fermentation ability，ethanol，total acid and amino nitrogen.

ethyl carbamate;urea;Chinese rice wine;DUR1，2 gene;yeast

Q786

A

1002－0306(2012)17－0173－04

2011－12－28 *通訊聯(lián)系人

朱旭亞(1987－)，女，在讀碩士研究生，研究方向:發(fā)酵工程。

紹興市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2009A21025)。