陳 穎，楊麗維，齊 欣，陳曉云，李明春，唐 柳，張 峻，*

(1.天津市林業(yè)果樹(shù)研究所，天津 300112;2.南開(kāi)大學(xué)微生物學(xué)系，天津 300071)

重組海藻糖合酶工程菌高密度發(fā)酵條件的研究

陳 穎1，楊麗維1，齊 欣1，陳曉云1，李明春2，唐 柳1，張 峻1，*

(1.天津市林業(yè)果樹(shù)研究所，天津 300112;2.南開(kāi)大學(xué)微生物學(xué)系，天津 300071)

目的:通過(guò)對(duì)前期構(gòu)建的海藻糖合酶基因工程菌進(jìn)行高密度發(fā)酵的研究，獲得了其高密度工藝條件。方法:采用搖瓶發(fā)酵和10L自控罐高密度發(fā)酵研究了培養(yǎng)基、pH、發(fā)酵方式對(duì)工程菌生長(zhǎng)及目的蛋白表達(dá)的影響，并考察了工程菌中重組質(zhì)粒的遺傳穩(wěn)定性。結(jié)果:海藻糖合酶基因工程菌高密度發(fā)酵的培養(yǎng)基為2YT+0.2%葡萄糖，最適pH為7.0，發(fā)酵方式為分批補(bǔ)料，通過(guò)10L自控罐高密度發(fā)酵最終得到的工程菌細(xì)胞密度達(dá)到了50.78g/L，酶活達(dá)到了3.197U/mL。所構(gòu)建的重組質(zhì)粒在宿主中得到了穩(wěn)定遺傳。結(jié)論:優(yōu)化了海藻糖合酶基因工程菌高密度發(fā)酵的條件，為海藻糖規(guī)?；a(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

海藻糖合酶，基因工程菌，高密度發(fā)酵

海藻糖合酶單酶法生產(chǎn)海藻糖，由于具有嚴(yán)格的底物專一性，原料易得，產(chǎn)物組成簡(jiǎn)單等特點(diǎn)成為近幾年酶法生產(chǎn)海藻糖的研究熱點(diǎn)［1］。海藻糖合酶由日本株式會(huì)社林原生物化學(xué)研究所首先發(fā)現(xiàn)［2］，隨后，Tsusaki等人利用放射性探針篩選基因組DNA文庫(kù)的方法，分別從Pimelobacter sp.R48和水生棲熱菌(Thermus aquaticus ATCC33923)中克隆得到了海藻糖合酶的基因［3－4］，這是最早的對(duì)海藻糖合酶基因的報(bào)道。隨后不久，De Smet等人克隆了結(jié)核分枝桿菌的海藻糖合酶，并在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了異源表達(dá)［5］。目前，來(lái)源于多種菌株的海藻糖合酶基因均已在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了表達(dá)。然而產(chǎn)海藻糖合酶基因工程菌普遍存在的產(chǎn)酶水平較低、酶制備成本較高等不利因素，限制了其工業(yè)化應(yīng)用?；蚬こ叹?細(xì)胞)的高密度發(fā)酵是外源基因?qū)崿F(xiàn)高水平表達(dá)，獲得大量外源基因產(chǎn)物的重要工藝技術(shù)。高密度發(fā)酵技術(shù)不僅可減少培養(yǎng)體積，強(qiáng)化下游分離提取，還可以縮短生產(chǎn)周期，減少設(shè)備投資從而降低生產(chǎn)成本，極大地提高其在市場(chǎng)上的競(jìng)爭(zhēng)力［6］。但外源蛋白的表達(dá)水平受宿主細(xì)胞、重組體的穩(wěn)定性、培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)方式、培養(yǎng)條件以及培養(yǎng)過(guò)程中抑制性代謝產(chǎn)物的積累等多種因素的影響，能否實(shí)現(xiàn)高密度培養(yǎng)及高目標(biāo)產(chǎn)物濃度，是工程菌能否以較低成本實(shí)現(xiàn)規(guī)模生產(chǎn)的決定性因素。蒙健宗、黃日波等人利用pH－stat法對(duì)重組海藻糖合酶工程菌進(jìn)行40L發(fā)酵罐分批補(bǔ)料發(fā)酵，最終獲得的細(xì)胞密度為51.5g/L，是分批培養(yǎng)的7.5倍。誘導(dǎo)后重組海藻糖合成酶表達(dá)率為15.2%，單位體積內(nèi)的表達(dá)量是分批培養(yǎng)的4.5倍［7］。本項(xiàng)目組從一株紅色亞棲熱菌中克隆得到了海藻糖合酶基因［8］，并利用混合質(zhì)粒PCR篩選的方法獲得了其全長(zhǎng)基因，構(gòu)建了含有海藻糖合酶基因的大腸桿菌質(zhì)粒(PET21TreS)，并將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21a中，得到了重組海藻糖合酶的基因工程菌［9］。本文以該工程菌為生產(chǎn)菌株，對(duì)其進(jìn)行高密度發(fā)酵條件的優(yōu)化和研究。

表1 7種不同培養(yǎng)基組成成分Table 1 Different components of seven culture mediums

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

海藻糖合酶基因工程菌(PET21TreS/BL21(DE3)) 南開(kāi)大學(xué)生命科學(xué)院構(gòu)建，－20℃甘油凍干保存;平板培養(yǎng)基 LB固體培養(yǎng)基加終濃度100μg/mL的氨芐青霉素;種子培養(yǎng)基 LB液體培養(yǎng)基加終濃度100μg/mL的氨芐青霉素;高密度發(fā)酵培養(yǎng)基 選取大腸桿菌發(fā)酵常用培養(yǎng)基，并通過(guò)改良，比較了7種不同組分的培養(yǎng)基(見(jiàn)表1)對(duì)海藻糖合酶基因工程菌高密度發(fā)酵的細(xì)胞密度與酶活的影響;補(bǔ)料培養(yǎng)基 胰蛋白胨 128g/L，酵母粉 80g/L，硫酸鎂10g/L，葡萄糖448g/L;胰蛋白胨、酵母粉、氨芐青霉素、IPTG、咪唑 北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司;葡萄糖 天津光復(fù)科技發(fā)展有限公司，分析純;泡敵 天津開(kāi)發(fā)區(qū)樂(lè)泰化工有限公司，分析純。

10－100L自控發(fā)酵罐 鎮(zhèn)江東方生物工程設(shè)備技術(shù)有限公司;智能型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 上海之信儀器有限公司;恒溫振蕩器 太倉(cāng)市科教器材廠;電子顯微鏡 日本HITACHI公司;超凈工作臺(tái) 天津醫(yī)療凈化設(shè)備廠;高速冷凍離心機(jī) 湘儀離心機(jī)公司;雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 海藻糖合酶基因工程菌搖瓶發(fā)酵條件的確定

1.2.1.1 高密度發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選 種子液制備:挑取一陽(yáng)性轉(zhuǎn)化菌落接種于5mL含100μg/mL氨芐青霉素的種子培養(yǎng)基中，37℃，過(guò)夜培養(yǎng)。發(fā)酵培養(yǎng):按1%接種量將種子液分別接種至7種不同發(fā)酵培養(yǎng)基中(500mL三角瓶裝液 100mL)，37℃，pH7.0發(fā)酵培養(yǎng)。按照 pH－stat法，定時(shí)補(bǔ)料2mL。發(fā)酵20h后，加入終濃度1.0mmol/L的IPTG溶液，37℃，pH7.0條件下誘導(dǎo)4h。定時(shí)取樣測(cè)葡萄糖濃度、細(xì)胞密度及酶活。

1.2.1.2 發(fā)酵方式對(duì)細(xì)胞密度及酶活的影響 分批發(fā)酵:按1%接種量將種子液接種至100mL 2YT培養(yǎng)基中(裝于500mL三角瓶中)，發(fā)酵50h，定時(shí)取樣測(cè)細(xì)胞密度。分批補(bǔ)料發(fā)酵:按1%接種量將種子液接種至100mL 2YT培養(yǎng)基中(含0.2%葡萄糖)，定時(shí)取樣測(cè)葡萄糖濃度，當(dāng)初始葡萄糖耗盡后開(kāi)始補(bǔ)料。按pH－stat法補(bǔ)料，定時(shí)取樣測(cè)細(xì)胞密度，并通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察菌體生長(zhǎng)狀況。

1.2.1.3 高密度發(fā)酵最適pH 按1%接種量將種子液分別接種至 pH 為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0不同條件下的2YT+葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基中(500mL三角瓶裝液100mL)，37℃發(fā)酵培養(yǎng)。按照pH－stat法，定時(shí)添加補(bǔ)料液。定時(shí)取樣測(cè)細(xì)胞密度和酶活。

1.2.2 10L自控發(fā)酵罐高密度發(fā)酵

1.2.2.1 種子液的制備 一級(jí)種子液:取平板上陽(yáng)性轉(zhuǎn)化的單個(gè)菌落接于5mL含終濃度100μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃過(guò)夜培養(yǎng)。二級(jí)種子液:將上述一級(jí)種子液離心清洗后以1%的接種量接于100mL含終濃度100μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD600在0.6～0.8，備用。

1.2.2.2 10L自控式發(fā)酵罐培養(yǎng)條件 10L發(fā)酵罐裝發(fā)酵培養(yǎng)基4L，將種子液按2.5%接種量接入，保持罐溫 37℃、pH7.0、罐壓 0.05MPa、攪拌速率 500～600r/min、通氣量 6～7L/min，通過(guò) pH－stat法控制補(bǔ)料，定時(shí)取料檢測(cè)。

1.2.2.3 質(zhì)粒穩(wěn)定性研究［10］分別于 3、12、20、26h取樣，考察不同時(shí)間不同條件下質(zhì)粒的缺失率，來(lái)判定質(zhì)粒的穩(wěn)定性。取一接種環(huán)發(fā)酵液溶于3mL的LB液體培養(yǎng)基中，適當(dāng)稀釋后取40μL涂LB平板，37℃過(guò)夜培養(yǎng)后，挑取100個(gè)單菌落于含終濃度100μg/mL氨芐青霉素的LB平板上，37℃培養(yǎng)16h后，計(jì)算菌落個(gè)數(shù)。

質(zhì)粒穩(wěn)定性(%)=添加Amp平板上的菌落數(shù)/不添加Amp平板上的菌落數(shù)×100

1.3 分析方法

1.3.1 生物量分析(OD600) 取0.5mL發(fā)酵液定量稀釋后于600nm處測(cè)吸光度。

1.3.2 葡萄糖含量測(cè)定 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線法。

1.3.3 酶活測(cè)定 將發(fā)酵后的粗酶液超聲破碎后，將1mL粗酶液加入到1mL以pH7.0、10mmol/L的磷酸緩沖液配制的2%(w/v)的海藻糖溶液中，50℃反應(yīng)60min，然后于100℃加熱10min中止酶反應(yīng)。反應(yīng)混合物冷卻后12000r/min離心10min，取上清液用0.22μm的濾膜過(guò)濾，用高效液相色譜法測(cè)定生成的海藻糖含量。

酶活力單位定義為:在上述反應(yīng)條件下，每分鐘形成1μmol海藻糖所需的酶量定義為1U。

2 結(jié)果與討論

2.1 高密度發(fā)酵培養(yǎng)基

實(shí)驗(yàn)通過(guò)搖瓶發(fā)酵對(duì)7種大腸桿菌常用培養(yǎng)基(見(jiàn)表1)進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)比較，發(fā)現(xiàn)以2YT加0.2%葡萄糖為發(fā)酵培養(yǎng)基時(shí)，工程菌的細(xì)胞密度和酶活均高于其它7種培養(yǎng)基(圖1～圖2)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在培養(yǎng)基中加入一定濃度的葡萄糖有助于菌體的生長(zhǎng)，尤其在菌體生長(zhǎng)的中后期，細(xì)胞密度較未加葡萄糖的提高35%，這說(shuō)明海藻糖合酶基因工程菌在生長(zhǎng)階段，尤其是對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期對(duì)碳源和氮源的需求量比較大，而2YT培養(yǎng)基富含豐富的氮源，再加入一定量的葡萄糖，能滿足菌體快速生長(zhǎng)的需要。

圖1 不同培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)的細(xì)胞密度Fig.1 The cell density after different culture medium fermentation

圖2 不同培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)后的酶活Fig.2 The enzyme activity after fermentation in different medium

2.2 發(fā)酵方式的比較

實(shí)驗(yàn)對(duì)分批發(fā)酵與分批補(bǔ)料發(fā)酵進(jìn)行了比較(圖3)，分批補(bǔ)料培養(yǎng)過(guò)程中，實(shí)驗(yàn)采用了pH－stat法通過(guò)對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行定時(shí)補(bǔ)料和加堿，始終控制發(fā)酵液pH維持在7.0左右。取樣檢測(cè)結(jié)果顯示，分批發(fā)酵的細(xì)胞密度生長(zhǎng)速度很快，但20h后呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)，而分批補(bǔ)料發(fā)酵前期緩慢生長(zhǎng)，但最高細(xì)胞濃度明顯大于分批發(fā)酵。經(jīng)進(jìn)一步鏡檢發(fā)現(xiàn)，24h后分批發(fā)酵菌體有自溶現(xiàn)象(圖4)，而分批補(bǔ)料由于連續(xù)不斷地為菌體生長(zhǎng)提供了豐富的碳源和氮源，24h后菌體仍保持正常分裂(圖5)。

圖3 不同發(fā)酵方式下菌體的生長(zhǎng)情況Fig.3 Cell growth after different fermentation mode culture

圖4 分批發(fā)酵24h后菌體生長(zhǎng)情況Fig.4 The bacterial growth after batch fermentation 24h

圖5 分批補(bǔ)料發(fā)酵24h后菌體生長(zhǎng)情況Fig.5 The bacterial growth after fed－batch fermentation 24h

2.3 最適pH

實(shí)驗(yàn)分別于發(fā)酵5、24、31、48h取樣比較不同pH下(pH 分別為 6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)菌體生長(zhǎng)情況及酶活大小(見(jiàn)圖6～圖7)，發(fā)現(xiàn)pH7.0時(shí)細(xì)胞密度及酶活均優(yōu)于其他pH條件，因此后面的實(shí)驗(yàn)均采用7.0作為發(fā)酵pH。

圖6 不同時(shí)間不同pH培養(yǎng)的細(xì)胞密度(OD600)Fig.6 The cell density after different time and different pH fermentation

2.4 10L自控罐分批補(bǔ)料發(fā)酵條件

圖7 不同pH發(fā)酵培養(yǎng)48h后的酶活Fig.7 The enzyme activity after different pH fermentation 48h

實(shí)驗(yàn)采用10L自控式發(fā)酵罐，裝料量為4L，通氣量為7L/min，pH7.0，保持罐溫 37℃，罐壓 0.05MPa，攪拌速率500～600r/min，消泡以泡敵手動(dòng)消泡，其余條件均為自動(dòng)控制。按照發(fā)酵過(guò)程中發(fā)酵液的pH變化設(shè)定補(bǔ)料時(shí)間，補(bǔ)料采用連續(xù)流加的方式，培養(yǎng)24h后收集發(fā)酵液備用。

2.4.1 海藻糖合酶工程菌高密度發(fā)酵過(guò)程中pH及溶解氧的變化 發(fā)酵過(guò)程中采用pH－stat法，設(shè)定初始pH為7.0，發(fā)酵罐裝液量為4L，通氣量為6L/min，罐溫始終保持在37℃，罐壓始終保持在0.05MPa。發(fā)酵初始，發(fā)酵液pH始終呈下降趨勢(shì)，表明菌體充分利用了發(fā)酵液中的初始葡萄糖，并產(chǎn)生了發(fā)酵副產(chǎn)物乙酸使得發(fā)酵液pH下降，實(shí)驗(yàn)通過(guò)自動(dòng)添加15%氨水調(diào)整pH為7.0。發(fā)酵至240min左右，發(fā)酵液pH持續(xù)上升(每分鐘上升0.01)。取樣測(cè)葡萄糖濃度后發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵液中的初始葡萄糖已基本耗盡。而此時(shí)菌體生長(zhǎng)代謝產(chǎn)生的銨離子使發(fā)酵液的pH持續(xù)升高。此時(shí)通過(guò)連續(xù)流加補(bǔ)充葡萄糖和氮源，使得菌體重新利用葡萄糖并產(chǎn)生乙酸使發(fā)酵液pH回落至7.0。補(bǔ)料20h后停止補(bǔ)料，以致發(fā)酵后期pH持續(xù)上升(見(jiàn)圖8)。

圖8 重組海藻糖合酶工程菌高密度發(fā)酵走勢(shì)圖Fig.8 High density fermentation chart of recombinant trehalose synthase engineering

隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)溶解氧迅速下降。發(fā)酵3h左右，溶解氧降至5%左右，此時(shí)調(diào)整轉(zhuǎn)速，將轉(zhuǎn)速由500r/min提高至600r/min后，溶解氧上升至25%左右，隨后很快又下降，直至發(fā)酵4h后降至10%。由于實(shí)驗(yàn)條件有限無(wú)法通入純氧來(lái)維持菌體生長(zhǎng)的需要，因此在一定程度上影響了菌體的比生長(zhǎng)率。

2.4.2 海藻糖合酶工程菌高密度發(fā)酵過(guò)程中細(xì)胞濃度與葡萄糖濃度的變化 如圖9所示，細(xì)胞密度快速上升的同時(shí)發(fā)酵液中的葡萄糖濃度迅速下降，說(shuō)明菌體生長(zhǎng)過(guò)程對(duì)葡萄糖的利用很快。初始葡萄糖的添加濃度為2g/L，縮短了前期初始葡萄糖的耗盡時(shí)間，延長(zhǎng)了補(bǔ)料時(shí)間，從而使得發(fā)酵液中的葡萄糖濃度始終處于一個(gè)較低水平(＜1g/L)，有效控制了乙酸的生成，延長(zhǎng)了菌體對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的時(shí)間。實(shí)驗(yàn)于發(fā)酵中后期(20h)加入1.0mmol/L的誘導(dǎo)劑進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)溫度為37℃，時(shí)間為4h。

圖9 10L高密度發(fā)酵過(guò)程中細(xì)胞密度與葡萄糖濃度的變化Fig.9 The cell density and glucose concentration changes of 10L high－density fermentation process

2.5 10L自控罐高密度發(fā)酵與常規(guī)發(fā)酵的比較

通過(guò)pH－stat法進(jìn)行重組海藻糖合酶10L自控罐高密度發(fā)酵，并改進(jìn)了發(fā)酵培養(yǎng)基和補(bǔ)料策略，最終獲得的細(xì)胞密度達(dá)到LB搖瓶發(fā)酵的21倍，酶活為L(zhǎng)B培養(yǎng)基搖瓶發(fā)酵的5.5倍。

表2 10L自控罐高密度發(fā)酵與常規(guī)發(fā)酵的細(xì)胞密度及酶活比較Table 2 The cell density and activity of 10L high cell density and conventional fermentation

2.6 質(zhì)粒穩(wěn)定性研究

通過(guò)考察不同時(shí)間段溫度、pH、溶解氧及補(bǔ)料條件等因素對(duì)質(zhì)粒穩(wěn)定性的影響(見(jiàn)表3)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)發(fā)酵前期在溫度、pH、壓力恒定的條件下，溶解氧 ＞40%時(shí)，質(zhì)粒穩(wěn)定遺傳達(dá)能到100%。發(fā)酵12h時(shí)，溫度、pH、壓力恒定的條件下，溶解氧降到10%左右，而通過(guò)補(bǔ)料，質(zhì)粒穩(wěn)定性仍能達(dá)到100%，發(fā)酵至24h后其他條件不變，而溶解氧＜10%(已經(jīng)持續(xù)10h)，質(zhì)粒穩(wěn)定性能達(dá)到95%，證明重組海藻糖合酶菌株在高密度發(fā)酵過(guò)程中能正常遺傳。

表3 重組海藻糖合酶工程菌質(zhì)粒穩(wěn)定性Table 3 Plasmid stability of recombinant trehalose synthase engineering

3 結(jié)論

3.1 海藻糖合酶工程菌高密度發(fā)酵條件的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)已構(gòu)建的海藻糖合酶基因工程菌進(jìn)行搖瓶發(fā)酵條件的研究，確定了海藻糖合酶基因工程菌高密度發(fā)酵的最適培養(yǎng)基為2YT培養(yǎng)基，發(fā)酵初始葡萄糖濃度為0.2%，菌體生長(zhǎng)最適pH為7.0，最佳發(fā)酵方式為分批補(bǔ)料法。

3.2 10L自控式發(fā)酵罐高密度發(fā)酵的研究

實(shí)驗(yàn)采用10L自控式發(fā)酵罐，裝液量為4L，發(fā)酵溫度為37℃，pH為7.0，通氣量為7L/min，罐壓為0.05MPa。通過(guò)pH－stat法控制加堿和定時(shí)補(bǔ)料，發(fā)酵過(guò)程中以15%氨水控制加堿，在初始葡萄糖耗盡后(發(fā)酵4h)定時(shí)補(bǔ)料，將發(fā)酵液pH維持在7.0左右，補(bǔ)料方式為連續(xù)流加，補(bǔ)料液的體積為總發(fā)酵液的20%，流速為 0.7mL/min，葡萄糖濃度維持在＜1g/L，以減少副產(chǎn)物乙酸的生成，延長(zhǎng)了工程菌對(duì)數(shù)期的生長(zhǎng)時(shí)間，大大提高了菌體的發(fā)酵密度，最終得到的海藻糖合酶基因工程菌的細(xì)胞密度達(dá)到了50.78g/L。在發(fā)酵20h后加入濃度為1.0mmol/L的IPTG誘導(dǎo)、誘導(dǎo)溫度為37℃、誘導(dǎo)時(shí)間為4h，得到的重組海藻糖合酶的酶活達(dá)到了3197U/L，為L(zhǎng)B搖瓶發(fā)酵的5.5倍。

3.3 質(zhì)粒穩(wěn)定性

10L自控罐發(fā)酵過(guò)程中基因工程菌的質(zhì)粒穩(wěn)定性達(dá)到了95%以上，說(shuō)明重組海藻糖合酶工程菌的質(zhì)粒比較穩(wěn)定，在高密度過(guò)程中可正常遺傳。

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High cell density fermentation condition of trehalose synthase genetic engineering bacteria

CHEN Ying1，YANG Li－wei1，QI Xin1，CHEN Xiao－yun1，LI Ming－chun2，TANG Liu1，ZHANG Jun1，*
(1.Tianjin Institute of Forest and Pomology，Tianjin 300112，China;2.Department of Microbiology，Nankai University，Tianjin 300071，China)

Object:To obtain the high dense fermentation procedure of trehalose synthase(Tres)genetic engineering bacteria previously construct.Methods:Studied the influence of medium，pH，ferment mode for incubation and induction on the growth of recombinant genetic engineering bacterial and expression of target protein in a 10L auto control biostat fermentator，and explored the genetic stability of recombinant plasmid.Result:The high－density culture medium of trehalose synthase genetic engineering bacteria was 2YT+0.2%glucose，the optimum pH was 7.0，the ferment mode was fed－batch.After the recombinant genetic engineering bacterial strain cultured in 10L high－density fermentation，the density of bacteria reached 50.78g/L，the enzyme activity reached 3.197U/mL.The constructed recombinant plasmid was inherited steadily in host bacteria.Conclusion:The high－density fermentation condition of trehalose synthase genetic engineering bacteria was optimized.It laid a foundation of large－scale production of trehalose.

trehalose synthase(Tres);genetic engineering bacteria;high－density fermentation

TS201.2

A

1002－0306(2012)17－0154－05

2012－02－22 *通訊聯(lián)系人

陳穎(1977－)，女，碩士，助理研究員，主要從事食品微生物和食品加工方面的研究。

天津市應(yīng)用基礎(chǔ)及前沿技術(shù)研究計(jì)劃(10JCYBJC09600，10JCYBJC05000);國(guó)家自然科學(xué)基金(21076162)。