杜秀園，任海偉，姚學(xué)平，王志凡

(1.西北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州 730030;

2.蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州 730050;

3.甘肅白銀熙瑞生物工程有限公司，甘肅白銀 730913)

羧甲基菊粉的制備及其抗氧化活性研究

杜秀園1，任海偉2，*，姚學(xué)平3，王志凡1

(1.西北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州 730030;

2.蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州 730050;

3.甘肅白銀熙瑞生物工程有限公司，甘肅白銀 730913)

采用氫氧化鈉－氯乙酸反應(yīng)體系，以異丙醇作為溶劑制備羧甲基菊粉(CMI)，并研究其抗氧化活性。以取代度為指標(biāo)，通過單因素及正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化CMI制備條件，并對其·OH清除活性和紅外光譜進(jìn)行研究。結(jié)果表明，CMI制備的最佳條件為堿化時(shí)間3min，氯乙酸用量6.75g，異丙醇用量4mL，醚化時(shí)間15min，該條件下取代度為1.3327?？寡趸钚匝芯勘砻?，CMI具有一定的·OH清除能力，且與濃度呈正相關(guān)效應(yīng)，但與取代度之間卻無確定關(guān)系。紅外光譜分析表明CMI的制備工藝可行，應(yīng)用前景廣闊。

羧甲基菊粉，取代度，抗氧化活性，紅外光譜

菊芋(Helianthus tuberosu)俗稱洋姜，為菊科向日葵屬多年生宿根性草本植物，其塊莖富含菊粉，含量達(dá)15%～20%。菊粉是由D－呋喃果糖以β－(2－1)糖苷鍵連接而成的多聚直鏈果糖，是自然界天然存在的可溶性膳食纖維，衛(wèi)生部于2009年批準(zhǔn)菊粉為新資源食品。菊粉具有多種藥理活性，增殖腸道雙歧桿菌，預(yù)防腸道感染;降低心血管疾病危害;促進(jìn)礦物質(zhì)吸收;防治便秘;防治骨質(zhì)疏松等［1－2］。研究表明，對糖類物質(zhì)進(jìn)行適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)修飾可以提高其生物活性或拓展其生物利用度。目前，已有學(xué)者對菊粉的硫酸化、羧甲基化和氰乙基醚化進(jìn)行了初步研究［3－6］，其中羧甲基化研究最為廣泛。羧甲基菊粉(CMI)是將菊粉分子上的伯醇或仲醇基團(tuán)被羧甲基取代，可廣泛應(yīng)用于多種領(lǐng)域，如用作阻垢劑及金屬離子螯合劑，在制糖工業(yè)中用作CaCO3結(jié)晶沉淀的抑制劑［7］，在印染過程中用作洗除污染物的添加劑等。張利等［8］研究也發(fā)現(xiàn)CMI顯著影響CaCO3晶體形態(tài)并可減緩CaCO3溶液中pH降低的趨勢。因此，羧甲基菊粉具有很好的開發(fā)前景。目前針對羧甲基菊粉的研究多集中于制備方法和結(jié)構(gòu)分析［9－10］，筆者也曾對菊粉羧甲基化工藝進(jìn)行了初步研究，并制備得到羧甲基菊粉［11］，但對其制備條件的研究還不夠全面，而且對產(chǎn)品抗氧化活性的研究尚少。因此，本文研究CMI制備的最佳工藝條件，并探討其·OH清除能力，為菊粉新資源的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菊粉 白銀熙瑞生物工程有限公司;1－(吡啶基偶氮)－2－萘酚(PAN) 天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心;氯乙酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、氫氧化鈉、異丙醇、甲醇、3，5－二硝基水楊酸等 均為分析純;實(shí)驗(yàn)用水 超純水。

真空干燥器 無錫市泰諾實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司; PHSJ－3F酸度計(jì) 上海雷磁儀器廠;Cary50紫外可見分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司;HH－S數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠; SHB－ⅢA循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司;KQ－250DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;TG16－WS高速臺式離心機(jī) 長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司;Nexus670 FT－IR傅立葉變換紅外光譜儀 美國尼高力公司。

1.2 分析方法

1.2.1 取代度的測定 采用硫酸銅絡(luò)合滴定法［12］。

1.2.3 紅外光譜分析 對菊粉和CMI進(jìn)行紅外光譜結(jié)構(gòu)分析。掃描范圍4000～400cm－1，掃描次數(shù)32次，分辨率4cm－1。

1.3 CMI制備的實(shí)驗(yàn)方法

準(zhǔn)確稱取2.70g菊粉和0.40g NaOH，在研缽中研磨均勻，置入燒杯中，在40℃、功率90W條件下超聲輔助進(jìn)行堿化反應(yīng);然后加入一定量的氯乙酸和0.58g NaOH混勻，滴加一定量的異丙醇溶劑(體積分?jǐn)?shù)為95%)后進(jìn)行醚化反應(yīng)(超聲輔助條件同上)。反應(yīng)結(jié)束后，所生成產(chǎn)物用甲醇洗滌至加入硝酸銀溶液中無沉淀為止，真空干燥制得CMI。

研究堿化時(shí)間(2.5、3.0、3.5、4.0、4.5m in)、氯乙酸用量(2.70、4.05、5.40、6.75、8.10g)、異丙醇用量(2、3、4、5、6m L)和醚化時(shí)間(10、15、20、25、30m in)四個(gè)因素對CM I取代度的影響。固定其它因素在3水平，研究其中某一因素對取代度的影響。然后在單因素基礎(chǔ)上進(jìn)行 L9(34)正交實(shí)驗(yàn)(見表1)，優(yōu)化制備工藝。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of the orthogonal tests

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 堿化時(shí)間對取代度的影響 菊粉羧甲基化修飾過程中，堿化處理目的是為了產(chǎn)生活化中心，因此堿化時(shí)間的長短對取代度至關(guān)重要。由圖1可知，隨著堿化時(shí)間的延長，CMI取代度總體呈現(xiàn)先增后減的趨勢，3.0m in時(shí)取代度達(dá)到最大值(1.31)。這是因?yàn)閴A化反應(yīng)階段為可逆過程，反應(yīng)時(shí)間并非越長越好，時(shí)間過長會導(dǎo)致菊粉發(fā)生降解，聚合度下降;而時(shí)間過短，則菊粉分子上的羥基轉(zhuǎn)化為氧負(fù)離子數(shù)量減少，致使取代度較低。只有堿化時(shí)間適宜，NaOH充分滲透到菊粉分子中，活性中心才相應(yīng)增加。因此堿化時(shí)間初步確定為3m in。

圖1 堿化時(shí)間對取代度的影響Fig.1 Effect of alkalization time on substitution degree of CMI

2.1.2 氯乙酸用量對取代度的影響 根據(jù)反應(yīng)原理，醚化反應(yīng)的速率與鹵代物濃度成正比。由圖2可知，隨著氯乙酸用量的增加，取代度逐漸增加，當(dāng)氯乙酸用量為6.75g時(shí)，取代度最大，之后又逐漸減小。這是因?yàn)殡S著氯乙酸用量增加，所提供的CH2COO－基團(tuán)增多，與菊粉反應(yīng)機(jī)率增加，有利于羧甲基化。但由于反應(yīng)條件處于堿性環(huán)境，氯乙酸容易消耗部分NaOH發(fā)生水解反應(yīng)，導(dǎo)致整個(gè)反應(yīng)體系pH降低，取代度下降。另外，氯乙酸用量的增加還會加劇副反應(yīng)，從而影響羧甲基化［14］。因此，初步確定氯乙酸用量為6.75g。

圖2 氯乙酸用量對取代度的影響Fig.2 Effect of chloroacetic acid amount on substitution degree of CMI

2.1.3 異丙醇用量對取代度的影響 由圖3可知，當(dāng)異丙醇量為5m L時(shí)，取代度最大。因?yàn)?，隨著異丙醇用量的增加，提高了菊粉的溶解性，從而增加了氯乙酸與菊粉分子活性中心的碰撞機(jī)會，有利于反應(yīng)進(jìn)行，表現(xiàn)為取代度逐漸增加。但若繼續(xù)增加異丙醇用量，取代度反而下降。因此，初步確定異丙醇用量為5m L。

2.1.4 醚化時(shí)間對取代度的影響 由圖4可知，隨著醚化時(shí)間的延長，菊粉與醚化劑氯乙酸能夠更加充分接觸，反應(yīng)物分子間碰撞機(jī)會增加，取代度逐漸增大。但反應(yīng)時(shí)間過長(＞20min)，超聲波通過分子振動頻率直接影響反應(yīng)體系的溫度，使反應(yīng)體系溫度升高，促進(jìn)氯乙酸水解副反應(yīng)加快，或者加劇菊粉在堿性環(huán)境中的降解，增加物料黏附，取代度反而下降。因此，初步確定醚化時(shí)間為20min。

圖3 異丙醇用量對取代度的影響Fig.3 Effect of isopropanol amount on substitution degree of CMI

圖4 醚化時(shí)間對取代度的影響Fig.4 Effect of etherification time on substitution degree of CMI

2.2 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化設(shè)計(jì)

在單因素結(jié)果基礎(chǔ)上，以取代度為指標(biāo)，選取堿化時(shí)間、氯乙酸用量、異丙醇用量和醚化時(shí)間四個(gè)因素進(jìn)行L9(34)正交實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果和極差分析見表2。

表2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Results and design test of the orthogonal tests

從表2極差分析可知，各因素對取代度的影響順序依次為:堿化時(shí)間＞氯乙酸用量＞醚化時(shí)間＞異丙醇添加量，最佳組合條件為A2B2C1D1，即堿化時(shí)間3m in，氯乙酸用量6.75g，異丙醇用量為4m L，醚化時(shí)間15min。由于優(yōu)化組合A2B2C1D1在上述9組實(shí)驗(yàn)中沒有，故對其進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。經(jīng)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明，A2B2C1D1組合的取代度為1.3327，均優(yōu)于其他組合。該最優(yōu)工藝條件下制備的CMI產(chǎn)物白細(xì)，且色澤均勻，感官狀態(tài)良好。

2.3 清除·OH活性的研究

羥自由基(·OH)是已知活性氧中對生物體毒性最強(qiáng)、危害最大的一種自由基，它可以與生物體內(nèi)的多種分子作用，造成糖類、氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸和脂類等物質(zhì)的氧化性損傷，使細(xì)胞壞死或突變?！H清除率是反映藥物抗氧化作用的重要指標(biāo)［14］。

由圖5可以看出，在所選濃度范圍內(nèi)，CMI對·OH具有較好的清除作用，而且與質(zhì)量濃度呈明顯的二次方量效關(guān)系。用Excel對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，回歸決定系數(shù)R2為0.99以上，回歸方程顯著。通過回歸方程，可得 CM I的半清除濃度 IC50為0.71g/L。

圖5 CMI對·OH清除能力與質(zhì)量濃度之間的關(guān)系Fig.5 Relationship between mass concentration and hydroxyl free radicals scavenging rate of CMI

CMI對·OH的清除能力，除了與質(zhì)量濃度有關(guān)系外，還與取代度大小有關(guān)。圖6為不同取代度下、質(zhì)量濃度為4g/L的CMI溶液對·OH清除率的變化趨勢。由圖6可知，隨著取代度的增大，CMI對·OH清除率總體呈增強(qiáng)趨勢，但取代度為0.6～0.8范圍對應(yīng)的清除率卻呈下降狀態(tài)，這說明影響·OH清除率的因素比較復(fù)雜，取代度和清除率之間沒有十分確定的對應(yīng)增長規(guī)律。

圖6 CMI對·OH清除能力與取代度之間的關(guān)系Fig.6 Relationship between substitution degree and hydroxyl free radicals scavenging rate of CMI

2.4 紅外光譜分析

菊粉和CMI的紅外光譜如圖7和圖8所示。由圖可知，菊粉分子中O－H伸縮振動在3421.28cm－1處有一強(qiáng)吸收峰，而菊粉經(jīng)羧甲基化后部分羥基被取代。CMI在1300～1650cm－1范圍出現(xiàn)羧酸鹽的特征吸收 峰:1606.25cm－1代表 COO－伸 縮 振 動，1404.94cm－1有與羰基相連的亞甲基的變形振動峰［15］。另外，1034.94cm－1處為醚鍵的 C－O伸縮振動，934.90cm－1是果糖基呋哺環(huán)的對稱伸縮振動所造成的，770.63cm－1是呋哺環(huán)次甲基的橫向振動造成的，說明羧甲基被引入到了菊粉分子中，制備工藝是可行的。

圖7 菊粉紅外光譜圖Fig.7 IR spectrum of inulin

圖8 羧甲基菊粉紅外光譜圖Fig.8 IR spectrum of carboxymethylinulin

3 結(jié)論

以菊粉為原料，取代度為指標(biāo)，確定的羧甲基菊粉最佳制備條件為:堿化時(shí)間3m in，氯乙酸用量為6.75g，異丙醇用量4m L，醚化時(shí)間15m in，該條件下取代度為1.3327?？寡趸钚匝芯勘砻鳎珻MI對·OH具有較好的清除作用，并隨著質(zhì)量濃度的增加清除作用逐漸增強(qiáng)，CMI的半清除濃度IC50為0.71g/L。然而，·OH清除率與取代度之間并無十分確定的對應(yīng)增長規(guī)律。通過紅外光譜進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征證實(shí)，利用羧甲基化修飾方法對菊粉分子進(jìn)行改性是可行的。菊粉經(jīng)羧甲基修飾后表現(xiàn)出較好的抗氧化活性，使其應(yīng)用范圍更加廣泛，具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景。

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Study on preparation and antioxidant activity of carboxymethyl inulin

DU Xiu－yuan1，REN Hai－wei2，*，YAO Xue－ping3，WANG Zhi－fan1
(1.College of Medicine，Northwestern University for Nationalities，Lanzhou 730030，China;
2.College of Life Science and Engineering，Lanzhou University of Technology，Lanzhou 730050，China;
3.Baiyin Xirui Biological Engineering Co.，LTD，Baiyin 730913，China)

Carboxymethyl inulin(CMI)was p repared in the reac tion system of NaOH－chloroacetic acid w ith isop ropanolas the solvent.The antioxidative activity of CMIwas studied.The p reparation technology of CMIwas op tim ized by sing le factor and orthogonal experim ents w ith the evaluation index of substitution deg ree.The scaveng ing ac tivities against hyd roxyl free rad icals and infrared spectrum of CMIwere stud ied.The results showed that the suitab le cond itions were as follows:alkalization tim e 3m in，chloroacetic acid am ount 6.75g，isop ropanol amount4m L，etherification time 15m in.The maximum substitution deg ree of CMIwas 1.3327 under the op timum reaction condition.Meanwhile，CM Ihad strong scavenging capacities against hyd roxyl free rad icals w ith a dosedependent effec t.Struc ture confirm ation by infrared spectroscopy(IR)p roved that the p reparation method of CMI was feasib le.

carboxym ethyl inulin(CMI);substitution deg ree;antioxidation ac tivity;infrared spec troscopy(IR)

TS201.2

B

1002－0306(2012)19－0224－04

2012－04－16 *通訊聯(lián)系人

杜秀園(1990－)，女，本科，研究方向:護(hù)理營養(yǎng)學(xué)。