王 健，吳永沛，于立國

(集美大學生物工程學院，福建廈門 361021)

超濾制備海帶巖藻聚糖的工藝研究

王 健，吳永沛*，于立國

(集美大學生物工程學院，福建廈門 361021)

本文以海帶為原料，研究應用超濾技術提取巖藻聚糖的工藝技術參數，研究結果表明:冷浸提法可以防止巖藻聚糖的降解;pH低于2.5時80%以上的褐藻酸會被除去;超濾過程中，壓力在0.1～0.3MPa范圍內隨著壓力的升高膜通量升高;浸提液經稀釋0～2倍下膜通量升高，多糖得率變化不大。研究結論:在4℃下以料液比1∶30浸提5h所得浸提液，調pH至2.0以除去褐藻酸，補蒸餾水至3000mL，采用50ku超濾膜組件在0.2MPa下超濾純化巖藻聚糖，經醇沉冷凍干燥制得高純度海帶巖藻聚糖干品，其得率為2.32%，總糖含量為38.24%，硫酸基團含量達到21.49%。

海帶，巖藻聚糖，超濾

巖藻聚糖是具有多種生物活性的硫酸多糖［1］，主要含有L－巖藻糖和硫酸基團，除此之外還含有半乳糖、甘露糖、葡萄糖、糖醛酸、木糖、鼠李糖、阿拉伯糖、氨基己糖等，化學成分極為復雜，具有抗病毒、抗凝血、抑制腫瘤以及調節(jié)免疫等功能［2－3］。巖藻聚糖分子量分布很廣，從幾萬到上百萬，具有種屬差異性［4］。海帶中含有豐富的巖藻聚糖，在功能性食品、醫(yī)藥等方面具有廣闊的應用前景。福建省海岸線長，海帶養(yǎng)殖基地帶已成規(guī)模，為海帶深加工奠定了基礎。膜分離技術是一門新興多學科交叉的分離純化技術，由于其在分離過程中不發(fā)生相變，選擇性高，低能耗，可在常溫和低溫下進行操作，適合處理具有熱敏性和生物活性的物質［5－6］，現已廣泛應用于果蔬汁加工、紡織印染及中藥分離純化等領域［7］，近年來發(fā)展十分迅速，尤其在食品行業(yè)中應用廣泛。本論文以過80目篩的海帶粉為原料，采用超濾膜分離純化分子量50ku以上的天然巖藻聚糖，并對工藝進行了優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

海帶粉 為福建省海域人工養(yǎng)殖海帶經烘干、粉碎而成，購于福清日紀食品有限公司，過80目篩備用;實驗用50ku的超濾膜 廈門市三達膜公司;蒽酮 廣州汕頭西隴化學試劑廠，色譜純;濃硫酸 廣東汕頭西隴化學試劑廠，色譜純;明膠 上海生工生物工程有限公司。

超濾機 廈門市三達膜公司;BS224S電子天平 北京賽多利斯儀器系統有限公司;高速冷凍離心機和Thermo真空冷凍干燥器 美國Thermo公司; UV－755B型紫外可見分光光度計 上海分析儀器有限公司;pH211臺式酸度測定儀 北京哈納公司; HH－2數顯恒溫水浴鍋 金壇市富華儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 超濾實驗技術方案 100g海帶粉以1∶30的料液比在4℃下浸提5h→4000r/min高速冷凍離心→取上清液調pH至酸性以除去褐藻酸→4000r/min高速冷凍離心→上清液調pH=7.0→低溫超濾濃縮→乙醇沉淀多糖→高速冷凍離心→取沉淀真空冷凍干燥→檢測理化性質

1.2.2 多糖含量的測定 采用蒽酮－硫酸比色法測定樣品多糖含量［8］，總糖標準曲線如圖1所示。

圖1 總糖標準曲線Fig.1 The standard curve of total sugar

1.2.3 SO42－含量的測定 采用硫酸鋇－明膠法測定SO42－含量，標準曲線如圖2所示。

圖2 硫酸根標準曲線Fig.2 The standard curve of SO42－

1.2.4 溫度對多糖降解的影響 將1g樣品巖藻聚糖溶于400m L蒸餾水中，分別在20、40、60、80℃水浴中保溫靜置2h，之后用濾紙抽濾去除懸浮雜質，再經10ku的超濾膜分離，取過濾液測總糖含量(以1g樣品巖藻聚糖溶于400m L蒸餾水所得溶液直接過抽濾進行超濾所得濾液為空白對照)。

其中:m1為濾出液中糖的質量;m為空白對照。

1.2.5 pH對多糖降解的影響 將1g樣品巖藻聚糖溶于400m L蒸餾水中，常溫下分別在pH=1、1.5、2、2.5、3攪拌2h，后用濾紙抽濾去除懸浮雜質，再經10ku的超濾膜分離，取過濾液測總糖含量(以1g樣品巖藻聚糖溶于400m L蒸餾水所得溶液直接過抽濾進行超濾所得濾液為空白對照)，計算降解率。

1.2.6 pH對提取液中褐藻酸脫除效果的影響 將在4℃下浸提離心所得浸提液的pH分別調至1.5、2.0、2.5、3.0，離心取褐藻酸沉淀，真空冷凍干燥，稱量褐藻酸的質量。

1.2.7 超濾過程壓力對膜通量的影響 經4℃浸提離心后得到的浸提液的pH調至2，經離心除褐藻酸。除去褐藻酸后的溶液補蒸餾水至3L，在壓力P=0.1、0.15、0.2、0.25、0.3MPa下分別進行超濾濃縮，每隔10m in測定一次膜通量。

1.2.8 多糖濃度對超濾提取多糖的影響 去除褐藻酸的浸提液加蒸餾水至3L。取浸提液按3000m L 0%、100%、200%稀釋。在0.2MPa操作壓力下過50ku分子量的超濾膜。測定膜通量、多糖得率。

2 結果與分析

2.1 多糖降解的影響因素

2.1.1 溫度對多糖降解的影響 溫度對多糖降解的影響如圖3所示。隨著溫度的升高，降解率也隨之升高。當溫度低于40℃、或高于60℃時，降解率隨著溫度升高變化較小;溫度介于40℃和60℃之間時，降解率陡然升高。通過該實驗可知，高溫下提取多糖的方法會導致多糖發(fā)生降解。

圖3 溫度對多糖降解的影響Fig.3 The influence of temperature on degradation rate

2.1.2 pH對多糖降解的影響 pH對多糖降解率的影響如圖4所示。由圖可知，在酸性條件下，巖藻聚糖會發(fā)生降解，且pH越小，降解率就越高。

圖4 pH對多糖降解的影響Fig.4 The influence of pH on degradation rate

現有報道中，利用酸在高溫下提取巖藻聚糖的報道較多，粗糖的得率也較高。酸可以水解細胞壁中的纖維素，使細胞液中的多糖溶出。但是酸也會使糖的分子量和天然結構發(fā)生變化。

由上述兩個驗證實驗結果可知，高溫下利用酸水解制備巖藻聚糖會導致多糖水解，影響多糖的生物活性。由此，本論文參照文獻［9］，采用低溫水浸提的方法提取海帶巖藻聚糖，最大限度保護多糖的天然結構。

2.2 pH對提取液中褐藻酸脫除效果的影響

褐藻酸又名褐藻酸鈉、褐藻膠，是由β－D－甘露糖醛酸和α－L－古羅糖醛酸通過β－1，4－糖苷鍵連接形成的線形高分子多糖。褐藻酸在海帶中以褐藻酸鹽的形式存在，含量較高，在提取巖藻聚糖時是主要的雜質。褐藻酸的去除方法大致可分為兩種:一是利用CaCl2、MgCl2等鹽溶液中的金屬離子與褐藻酸生成褐藻酸鹽沉淀，用紗布過濾或離心后去除褐藻酸;二是利用褐藻酸在弱酸條件下不溶的性質，調節(jié)溶液pH至酸性使褐藻酸沉淀出來，過濾或離心分離出褐藻酸。也有報道用不同濃度的乙醇分級沉淀褐藻酸和巖藻聚糖，王作蕓等［10］研究銅藻中巖藻聚糖時，用體積分數30%的乙醇沉淀除去褐藻酸，再用80%的乙醇沉淀得到巖藻聚糖;西出英一［11］在用熱水提取巖藻聚糖時，調節(jié)多糖水溶液中MgCl2的濃度至0.05mol/L，以20%乙醇沉淀除去除褐藻酸。

本論文利用褐藻酸在酸性條件下不溶的性質去除褐藻酸。由圖5可知，當pH=3時，除褐藻酸的效果很不明顯;當pH下調至2.5時會有大量褐藻酸沉淀出來。pH=2時，除去的褐藻酸最多，質量達到干海帶粉的17%。相關文獻［12］報道，利用不同方法從干海帶中提取褐藻酸，產率在16.7%～20.9%。由此可知，本實驗褐藻酸的脫除效果相對文獻［12］所述，脫除率在80%以上。確定后續(xù)實驗調節(jié)浸提液pH=2除褐藻酸。

圖5 不同pH下褐藻酸脫除質量Fig.5 The influence of pH on removing alginate

2.3 超濾過程壓力對膜通量的影響

壓力是超濾得以進行的推動力，也是最重要的操作參數，它的改變直接影響到整個超濾傳質過程。超濾過程中不同時間下壓力與膜通量的變化如圖6、圖7所示。

圖6 不同時間點壓力對膜通量的影響Fig.6 The influence of pressure onmembrane flux

圖7 不同壓力下超濾10min的膜通量Fig.7 Membrane flux under different pressure at10min

Michales在1968年提出凝膠層理論，根據該理論，當溶質從溶液傳遞到膜表面的速率等于溶質擴散遠離膜表面回到溶液中的速率時，超濾過程中的膜表面的凝膠層的厚度不再增加，此時，相同條件下膜表面溶質濃度達到平衡濃度Cw;而超濾過程中溶質的傳質方程為:J=k ln(Cw/Cb)，其中J為膜通量，k為傳質系數，Cb為溶液濃度。圖6顯示，在超濾過程開始前15m in，膜通量迅速減小，這是由于膜表面形成的凝膠層的厚度逐漸增加且大顆粒阻塞膜孔的緣故;超濾15m in后凝膠層的厚度不再增加，膜通量變小的主要原因是由于隨著超濾過程的進行，溶液濃度不斷增大，Cw/Cb的值逐漸變小，k為常數，所以膜通量J逐漸減小，但減小的速率比在凝膠層逐漸形成過程中膜通量減小的速率要小得多。

由圖7可知，壓力低于0.15MPa時，隨著壓力的增加，膜通量也呈直線上升趨勢，此時超濾屬于壓力控制區(qū);當壓力在0.15～0.25MPa時，膜通量上升趨勢放緩;當壓力大于0.25MPa時，壓力幾乎對膜通量沒有影響，傳質達到平衡，此時超濾處于傳質控制區(qū)。由圖7可知，操作壓差應選擇0.2MPa，在接近傳質控制區(qū)的條件下進行操作，以免阻塞膜孔。

2.4 多糖濃度對超濾提取多糖的影響

多糖的濃度對超濾過程中膜通量的影響如圖8所示。由圖可知，隨著糖溶液濃度的降低，膜通量相應增加。當溶液的濃度較低時，濃差極化現象的影響程度相對較輕，膜表面形成的凝膠層厚度較薄;同時溶液中大分子的含量也較低，阻塞膜表面的孔的幾率也降低，膜的污染程度也就相對較低，膜通量則較大。相反，當濃度較高時，形成的凝膠層的厚度增加，膜孔堵塞導致膜受污染的幾率也增加，膜通量則減小。

圖8 不同時間點原料液稀釋倍數對膜通量的影響Fig.8 The influence of dilution on fucoidan extraction at different time

表1顯示，溶液的稀釋倍數越高，超濾過程中糖的損失量就越小，但由于處理的樣品濃度比較低，損失量也較小。處理相同質量的原料時，經稀釋的浸提液超濾所需時間增加，膜通量和多糖得率沒有太大的變化，因此綜合能耗考慮，后續(xù)實驗選擇不稀釋。

2.5 超濾工藝流程與產品理化指標

2.5.1 超濾技術制備海帶巖藻聚糖工藝流程 通過上述單因素研究可知，利用超濾在低溫下提取海帶巖藻聚糖的最佳工藝是:過80目篩海帶粉以1∶30的料液比在4℃下浸提5h→4000r/min高速冷凍離心去渣→上清液調pH至2除褐藻酸→4000r/min高速冷凍離心→上清液調pH至中性→補蒸餾水至3000mL→4℃下、利用50ku超濾膜組件在0.2MPa下超濾濃縮→濃縮液用乙醇沉淀多糖→高速冷凍離心→沉淀物真空冷凍干燥→檢測理化性質。

表1 糖液稀釋倍數對多糖得率的影響Table 1 The influence of dilution on fucoidan extraction

巖藻聚糖特有的結構、分子量大小和硫酸基團的含量是決定其諸多生物活性的關鍵因素，因此在從海帶中提取巖藻聚糖工藝研究中必須最大限度保護多糖的天然結構和分子量?，F有研究報道一般采用水浸提、酸浸提、堿浸提等方法從海帶中提取巖藻聚糖，隨著科學技術的發(fā)展，萃取、微波提取和超聲波輔助提?。?3］也被應用到巖藻聚糖的提取工藝中。用酸浸提或堿浸提提取巖藻聚糖，其得率相對水浸提要高，但是酸和堿會將天然多糖分子水解，使巖藻聚糖天然的結構和分子量發(fā)生改變;超聲波輔助提取雖然提高了巖藻聚糖的提取率、縮短了提取時間，但是超聲波較強的機械剪切力會使大分子多糖鏈斷裂，硫酸基團脫落。傳統的水浸提法雖然提取率沒有上述方法的高，但是最大限度保護了天然巖藻聚糖的結構。

在分離純化巖藻聚糖工藝中，目前多采用離子交換色譜和凝膠色譜法分離，但這兩種方法成本較高，處理量低，而且還僅限于實驗室應用。而超濾的規(guī)?；a在食品工業(yè)中的應用已經很成熟，但在制備巖藻聚糖中的應用還未見報道。由此，本研究采用低溫水浸提的方法和超濾相結合提取海帶巖藻聚糖，適合用于工業(yè)化大規(guī)模生產加工天然海帶巖藻聚糖。

2.5.2 產品理化指標 利用上述最佳提取工藝制備海帶巖藻聚糖，蒽酮－硫酸比色法測定總糖的含量，硫酸鋇－明膠法測定硫酸根的含量，結果如下:海帶提取巖藻聚糖的得率為2.32%，總糖含量為38.24%，硫酸根含量為21.49%，去除的褐藻酸占海帶粉的16.71%。

不同原料中提取的巖藻聚糖的提取率和硫酸基團的含量是不同的，比如，王維香等［14］用復合酶法從裙帶菜中提取巖藻聚糖，多糖得率為7.76%，何云海［15］用戊聚糖復合酶和復合纖維素酶酶解海帶提取巖藻聚糖，粗多糖得率僅為1.84%，本實驗用水浸提法從海帶中提取巖藻聚糖，多糖得率為2.32%;不同的方法對同一種原料進行巖藻聚糖的提取，得到的巖藻聚糖的提取率和硫酸根含量也是不盡相同的，劉翼祥［16］用酸提法從海帶中提取巖藻聚糖，粗品得率為5.51%，硫酸根含量為18.15%。本實驗粗多糖得率為2.32%，硫酸根含量為21.49%。

3 結論

本研究課題以海帶粉為原料提取巖藻聚糖，對最佳提取工藝條件進行了單因素分析，以料液比1∶30在4℃條件下水浸提5h，離心取上層清液，調節(jié)pH=2離心去除褐藻酸。超濾過程中，壓力范圍在0.1～0.3MPa都適合進行超濾操作，綜合考慮能耗和生產效率，最佳操作壓差為P=0.2MPa;隨著浸提液濃度的降低，膜分離后多糖的損失減小，但考慮到乙醇沉淀時乙醇的用量和損失量較大，在超濾時采取不稀釋的前處理;對凍干的樣品進行檢測，經該工藝提取的海帶巖藻聚糖的得率為2.32%，粗糖中總糖的含量為38.24%，硫酸根的含量為21.49%。由此可知，利用該工藝工業(yè)化制備天然海帶巖藻聚糖是可行的。

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Application of ultrafiltration on the extraction of fucoidan from kelp polysaccharide

WANG Jian，WU Yong－pei*，YU Li－guo
(College of Biological Engineering，Jimei University，Xiamen 361021，China)

This paper stud ied that itwas feasib le to app lymemb rane separation technology to extrac t fucoidan from kelp polysaccharide.Also，the best technical parameters had been fixed on.It demonstrated that extraction in cold water could p rotec t fucoidan from deg radation.More than 80%of alginate could be removed at the cond ition of pH≤2.5.With the increasing of operating p ressure，memb rane flux would inc rease during the ultrafiltration p rocess. After diluting the extract 0～2times，memb rane flux increased，but the extracting ratio almost d idn’t changed.The results showed that the best extracting cond ition were:temperature 4℃，rate of material to liquid 1∶30，extract 5 hours.Alginate removed under the cond ition of pH=2.0 50ku of ultrafiltration membrane was used to purify fucoidan under the p ressure of 0.2MPa.The permeated liquid was p recip itated by ethanol and d ried by vacuum－freeze d rying.The yield of fucoidan was 2.32%.The compositions of totalsugar and sulphate were 38.24%and 21.49%.

kelp;polysaccharide;ultrafiltration

TS254.1

B

1002－0306(2012)19－0210－04

2012－05－18 *通訊聯系人

王健(1987－)，男，碩士，研究方向:農產品加工與貯藏。

國家海洋局公益項目(201205022－6)。