王新明，王聯(lián)結(jié)，于 猛

(陜西科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，陜西西安 710021)

牛血清蛋白對纖維素酶水解小麥秸稈的影響

王新明，王聯(lián)結(jié)*，于 猛

(陜西科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，陜西西安 710021)

在以分別被稀硫酸和氫氧化鈉處理的小麥秸稈為底物進行纖維素酶解時添加牛血清蛋白(BSA)來評估BSA對酶解的影響，當接入纖維素酶40U/g秸稈，添加牛血清蛋白0.04g時，反應(yīng)48h，還原糖得率分別提高30%和22%，添加牛血清蛋白后酸處理的秸稈水解速率更快，酶解液中酶失活趨勢減小，以濾紙為底物測定纖維素酶活力時添加牛血清蛋白能將酶活提高1倍以上，從而推斷牛血清蛋白可以提高纖維素酶的穩(wěn)定性并減少酶因吸附木質(zhì)素而失活，提高酶的水解效率。

牛血清蛋白，纖維素酶，木質(zhì)纖維素，水解

木質(zhì)纖維素是世界上最豐富的碳水化合物資源，由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素等組成，將其生物轉(zhuǎn)化可得到葡萄糖、木糖等單糖并可進一步制取乙醇、木糖醇、沼氣等食品和化工產(chǎn)品［1－3］。木質(zhì)纖維素生物轉(zhuǎn)化過程包括:利用有效的預(yù)處理方法破壞原料的物理結(jié)構(gòu)并且除去原料中的木質(zhì)素;酶解纖維素和半纖維素得到還原糖;發(fā)酵還原糖得到所需產(chǎn)品等［4］，目前轉(zhuǎn)化成本較高主要是由于預(yù)處理能耗大和酶解效率低［5］。在酶解過程中，纖維素酶的活性是影響水解反應(yīng)的關(guān)鍵［6］，酶解時添加表面活性劑或聚合物如吐溫、PEG6000、鼠李糖等［7－9］能減少纖維素酶的無效吸附，減小纖維素酶變性失活速率，從而大大提高水解效率［10］。牛血清蛋白(BSA)常被作為穩(wěn)定劑(Blocking reagent)應(yīng)用于蛋白質(zhì)印跡中提高限制酶的活性和穩(wěn)定性［11］，并被證實可以提高纖維素酶的酶解效率［12］，本研究以小麥秸稈為原料，對其進行一定的預(yù)處理，考察經(jīng)不同預(yù)處理后的小麥秸稈在牛血清蛋白存在時的纖維素酶解產(chǎn)糖效率及牛血清蛋白的作用機理。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小麥秸稈 2010年6月采集于陜西省渭南市，清洗后于60℃烘干，粉碎過60目篩，低溫密閉保存;纖維素酶 寧夏和氏璧生物技術(shù)有限公司(青霉菌液體發(fā)酵);牛血清蛋白 西安百靈克科技有限公司;3.5－二硝基水楊酸 化學(xué)純，上?？曝S化學(xué)試劑有限公司。

YX－280型電熱蒸汽消毒器 江陰溶江醫(yī)療設(shè)備廠;FW 100型高速萬能粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司;HZS－HA水浴振蕩器 哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠;722E型可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料預(yù)處理 堿處理:取粉碎后的秸稈與質(zhì)量分數(shù)為1%的NaOH以固液比(g/m L)1∶15混勻，100℃攪拌處理1h，趁熱抽濾并洗滌至中性，將濾渣烘干、粉碎過60目篩備用［13］。酸處理:取粉碎后的秸稈與質(zhì)量分數(shù)1%的硫酸以1∶15的固液比混勻。在蒸汽滅菌鍋中120℃處理1h，趁熱抽濾并洗滌至中性，將濾渣烘干、粉碎過60目篩備用［14］。

1.2.2 葡萄糖標準曲線的繪制 取干燥恒重的葡萄糖配制成質(zhì)量濃度為1mg/m L的溶液，分別吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2m L葡萄糖溶液于20m L具塞試管中，補加蒸餾水至 2m L，再加入 DNS溶液1.5m L，編號1～7。沸水浴10m in，立即冷卻，加水定容、搖勻。以1號管作為空白在540nm處進行比色，以葡萄糖質(zhì)量為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪制標準曲線。

1.2.3 纖維素酶解條件 取0.5g小麥秸稈粉置于50m L的三角瓶中，加入10m L濃度為0.075mol/L、pH為4.8的檸檬酸－檸檬酸鈉緩沖液，再加入20U纖維素酶和一定量的牛血清蛋白，密封后放置于50℃、轉(zhuǎn)速為70 r/m in的水浴振蕩器中，定時取樣測定酶解液中的還原糖量(以葡萄糖計)和纖維素酶的酶活。每次實驗重復(fù)三次，取三次實驗的平均值。

1.3 測定方法

原料組分測定:范氏洗滌法［15］;還原糖測定: 3.5－二硝基水楊酸法(DNS法)［16］;酶活測定:國際理論與應(yīng)用化學(xué)協(xié)會(IUPAC)的濾紙酶活測定方法，定義50℃時1min水解產(chǎn)生1μmol葡萄糖的酶量為一個酶活單位(U)［17］。

2 結(jié)果與討論

2.1 原料組分測定

用范氏洗滌法分別測定小麥秸稈、1%氫氧化鈉處理的秸稈、1%硫酸處理的秸稈的成分，基本成分組成如表1所示。從表1中可以看出小麥秸稈中木質(zhì)纖維總質(zhì)量分數(shù)達到75%以上，其中以還原糖縮合而成的纖維素和半纖維素質(zhì)量分數(shù)高達60%。秸稈經(jīng)堿處理溶解了大部分的木質(zhì)素，而酸處理后半纖維素大多被水解。

表1 小麥秸稈主要組分(%)Table 1 Themain component ofwheat straw(%)

2.2 葡萄糖標準曲線

葡萄糖標準曲線如圖1所示，回歸方程為y= 0.6439x－0.0094，R2=0.9995;當所測葡萄糖質(zhì)量在0～1.2mg時線性關(guān)系良好。

2.3 牛血清蛋白對纖維素酶活的影響

測定纖維素酶活力時，向反應(yīng)液中加入不同量的BSA，測得的酶活結(jié)果如圖2所示，加入BSA后酶活明顯提高，當加入10mg時酶活翻倍，當加入25mg時酶活是最初的2.5倍。纖維素酶是一種復(fù)合酶，它由外切葡聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶和β－糖苷酶三類酶組成，酶解過程包括吸附－解吸附和酶解兩個過程，在三類酶的協(xié)同作用下可以將纖維素水解成葡萄糖［18］。牛血清蛋白具有強的疏水性，在溶液中形成的膠束能加速底物、酶和產(chǎn)物的運動，促進酶的解吸附，提高底物和酶的有效吸附，從而使酶活明顯提高［11］。在圖3中可以看到BSA提高纖維素酶活與緩沖溶液濃度有關(guān)，當在反應(yīng)液中添加5mgBSA時，濃度為0.075mol/L的檸檬酸－檸檬酸鈉緩沖液中酶活提高最明顯。

圖1 葡萄糖標準曲線Fig.1 Standard curve of glucose

圖2 BSA對纖維素酶活的影響Fig.2 Effect of BSA on cellulase activity

圖3 不同緩沖溶液濃度下BSA對纖維素酶活的影響Fig.3 Effect of BSA on cellulase activity in different concentration of buffer

2.4 牛血清蛋白對纖維素酶水解小麥秸稈的影響

分別以酸處理和堿處理后的秸稈為底物，加入不同質(zhì)量的牛血清蛋白進行纖維素酶解，測定48h后產(chǎn)生還原糖的量如圖4所示。當加入0.04gBSA時經(jīng)堿處理的秸稈還原糖產(chǎn)量由0.123g提高到0.15g，單糖得率提高22%，酸處理的秸稈還原糖產(chǎn)量由0.1g提高到0.13g，單糖得率提高30%，牛血清蛋白能夠提高纖維素酶對小麥秸稈的水解率，對經(jīng)酸處理的秸稈比堿處理的秸稈提高效果更好，當加入的BSA繼續(xù)增加時還原糖產(chǎn)量提高不明顯。

2.5 牛血清蛋白對纖維素酶失活的影響

圖4 BSA對纖維素酶水解小麥秸稈的影響Fig.4 Effect of BSA on enzymatic hydrolysis of wheat straw

2.5.1 BSA對酶解速率的影響 取1g底物與30m L緩沖溶液混合，接入40U纖維素酶，考察經(jīng)過不同預(yù)處理方法處理的秸稈在添加0.04gBSA后的酶解速率并測定反應(yīng)液酶活變化。圖5中經(jīng)堿處理和酸處理后的秸稈在添加BSA時酶解得糖速率提高。由2.3知，當有BSA存在時纖維素酶酶活顯著提高，從而底物酶解率提高，但經(jīng)堿處理的秸稈在每個酶解時間段內(nèi)提高的糖量相當，而經(jīng)酸處理的秸稈酶解提高的糖量集中在前60h，添加BSA后酸處理的秸稈酶解速率較堿處理的秸稈快，這說明BSA對纖維素酶解效率的提高除了因為能提高酶活外還與底物的性質(zhì)有關(guān)。

圖5 BSA對經(jīng)不同方法處理的秸稈酶解的影響Fig.5 Effect of BSA on the enzymatic hydrolysis of straw following pretreatment by differentways

2.5.2 BSA對酶解液中酶活的影響 圖6中顯示的是在不同反應(yīng)時間測定的是否存在底物(酸處理的秸稈)和是否添加BSA的酶解液中纖維素酶的酶活。當沒有底物時，添加BSA后酶活明顯較大，而整體酶活都是隨時間降低的，在反應(yīng)液中纖維素酶失活主要因為氣液界面失活、產(chǎn)物抑制、機械失活、與底物中木質(zhì)素無效結(jié)合失活等［19－21］，一般酶的失活量與底物中的木質(zhì)素含量呈正比關(guān)系［22］。在圖中不添加底物的反應(yīng)液酶活降低趨勢大致相同，這說明添加BSA后并沒有減少纖維素酶氣液界面失活和機械攪拌失活;而有底物存在時，添加了BSA的反應(yīng)液比沒添加BSA的反應(yīng)液酶活降低趨勢明顯小，這說明BSA能減少酶與木質(zhì)素無效結(jié)合失活。

由2.1知，經(jīng)酸處理的原料比經(jīng)堿處理的原料木質(zhì)素含量多，酶解時酶與木質(zhì)素的無效吸附失活更明顯，添加BSA既能促進酶與纖維素的吸附和解吸，又能減少酶與木質(zhì)素的吸附失活，酶解速度和效率比堿處理后的原料提高更明顯。

3 結(jié)論

圖6 BSA對纖維素酶失活的影響Fig.6 Effect of BSA on deactivation of cellulase

牛血清蛋白能激活和協(xié)調(diào)纖維素酶體系中的各組分，加速酶在底物上的吸附和解吸咐，使酶活顯著提高。經(jīng)稀硫酸預(yù)處理的小麥秸稈半纖維素大多被水解，經(jīng)氫氧化鈉預(yù)處理的秸稈木質(zhì)素被溶解掉，他們進行纖維素酶解時加入牛血清蛋白還原糖得率提高，其中酸處理的秸稈酶解率提高集中在反應(yīng)前期，反應(yīng)速率較快，且最終還原糖得率提高更多。分析酶解液中的酶活發(fā)現(xiàn)，酸處理的秸稈在牛血清蛋白存在時酶活降低較緩慢，這是因為牛血清蛋白增強了酶的穩(wěn)定性，減小了纖維素酶在木質(zhì)素上的吸附失活。

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Effect of bovine serum album in on cellulase in hydrolysis ofwheat straw

WANG Xin－m ing，WANG Lian－jie*，YU M eng
(College of Life Science and Engineering，Shaanxi University of Science＆Technology，Xi’an 710021，China)

Bovine serum album in(BSA)and cellulase were added to wheat straw p retreated by d ilute sulfuric acid and sod ium hyd roxide to assess the effec t of BSA on the enzymatic hyd rolysis.0.04g BSA inc reased reducing sugar yields by 30%and 22%，respectively，ata cellulase loading of40U/g straw for48h.BSA imp roved the rate of enzymatic hyd rolysis and reduced enzyme deactivation of acid p retreated wheat straw.BSA increased cellulase activity by 1 time ormore w ith filter paper as substrate.The results showed that BSA could imp rove the stability of enzyme and reduced deactivation of enzyme due to bind ing w ith lignin.

bovine serum album in;cellulase;lignocellulose;hyd rolysis

Q556.2

A

1002－0306(2012)19－0194－04

2012－03－19 *通訊聯(lián)系人

王新明(1988－)，男，在讀碩士研究生，研究方向:生物質(zhì)開發(fā)與利用。