劉 毅，袁月華

(湖南機(jī)電職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物化工系，湖南長沙 410151)

混菌降解稻草纖維素產(chǎn)葡萄糖的條件研究

劉 毅，袁月華

(湖南機(jī)電職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物化工系，湖南長沙 410151)

利用從環(huán)境中篩選出的一株木霉與一株曲霉，在以稻草粉為主要碳源的液體培養(yǎng)基中混菌發(fā)酵，所得的粗酶液催化降解經(jīng)預(yù)處理的稻草粉得到葡萄糖液。在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，正交實(shí)驗(yàn)表明，粗酶液用量對稻草粉降解為葡萄糖影響最大，其次為溫度，然后是pH，稻草粉濃度對降解影響最小。稻草粉最優(yōu)降解條件為:粗酶液用量為降解液總體積的3%，降解液初始稻草粉濃度60g/L，pH4.8，降解溫度50℃，此條件下降解率可達(dá)80%。

混菌，降解，稻草，纖維素

通過微生物降解作用使稻草中主要成分纖維素降解為可生物利用的還原糖［1－2］，然后轉(zhuǎn)為有效能源，如乙醇或其它重要化工原料(乳酸、檸檬酸)等是稻草合理利用的有效途徑。為了提高降解效率，人們進(jìn)行了大量的研究工作［3－5］。我們從環(huán)境中篩選出了一株木霉［Trichoderma viride］(T1)和一株曲霉［Jspergillus sp］(T3)，在以稻草粉為主要碳源的液體發(fā)酵條件下這兩株菌有較強(qiáng)的產(chǎn)纖維素酶能力，兩菌混合發(fā)酵時(shí)纖維素酶活力明顯增強(qiáng)。但是，產(chǎn)纖維素酶的最佳條件與纖維素酶催化糖化稻草的最佳條件并不一致，所以，本文研究解決直接利用混合菌群發(fā)酵得到的粗酶液糖化稻草粉的條件，并對條件進(jìn)行優(yōu)化，以提高稻草纖維素降解為葡萄糖的產(chǎn)率。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

稻草粉 采自湖南省沅江市農(nóng)村水稻田(當(dāng)年產(chǎn))，洗凈后自然風(fēng)干，粉碎過40目篩，經(jīng)微波與堿聯(lián)合處理后洗凈干燥備用［6］;木霉［Trichoderma viride］(T1)和曲霉［Jspergillus sp］(T3) 本實(shí)驗(yàn)室篩選;液體產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基 40g固形物(稻草粉∶麩皮=3∶2)，(NH4)2SO42.0g，尿素3.0g，KH2PO43.0g，CaCl20.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，CoCl23.0mg，F(xiàn)eSO4· 7H2O 7.5 mg，ZnSO4·7H2O 2.0mg，MnSO4·H2O 2.5mg，加水至1000m L，pH5.5。

THZ－82恒溫振蕩水浴鍋 常州澳華儀器有限公司;HZQ－F100型全溫度振蕩培養(yǎng)箱 太倉市華美生化儀器廠;BS124S電子天平 德國賽多利斯; UV—1100紫外/可見分光光度計(jì) 上海益?zhèn)惌h(huán)境科技有限公司;YXQ－LS－30SII型立式壓力蒸汽滅菌器

上海博迅實(shí)業(yè)有限公司;SW－CJ－1FD型凈化工作臺(tái) 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 混菌粗酶液的制備 將木霉(T1)與曲霉(T3)按同濃度孢子懸液比值3∶2混合后，以5.5%接種量接入液體產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基中，在250m L三角瓶中裝液100m L，于28℃振蕩培養(yǎng)箱(180r/min)中振蕩培養(yǎng)144h。然后將發(fā)酵液用脫脂棉過濾除去菌體及雜質(zhì)，所得清液即本實(shí)驗(yàn)用稻草纖維素糖化酶粗酶液。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn) 降解反應(yīng)在250m L三角瓶中進(jìn)行。加入適量的粗酶制液和pH4.8的乙酸－乙酸鈉緩沖溶液，并按0.2g/g稻草粉加入Tween80［7］，混合均勻。控制總反應(yīng)液體積為100m L，在不同的粗酶液用量、稻草粉濃度、pH、糖化溫度等條件下進(jìn)行反應(yīng)，測定濾出液中的還原糖含量。

1.2.3 條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取粗酶液用量、稻草粉濃度、pH、溫度作為研究對象。按照4因素3水平L9(34)進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)［8］?？疾焯腔^程中各因素的影響水平大小，找出最優(yōu)糖化條件。降解正交實(shí)驗(yàn)的因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 稻草粉降解正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factor levels of degradation of rice straw powder by orthogonal experiment

1.2.4 還原糖的測定 還原糖采用DNS法測定［9］。

1.2.5 降解率(糖化率) 糖化率(%)=［降解反應(yīng)產(chǎn)生還原糖質(zhì)量(g)/稻草粉質(zhì)量(g)］×100

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 粗酶液用量對降解的影響 控制初始稻草粉濃度為80g/L，初始pH5.5，溫度50℃，分別加入不同體積的粗酶液，使粗酶液體積占反應(yīng)液總體積的0.5%、1%、2%、3%，降解48h，分析不同粗酶液用量對降解效率的影響，結(jié)果見圖1。

圖1表明，在本實(shí)驗(yàn)條件下，稻草降解為還原糖的得率隨著粗酶液用量的增加而增加，0～24h降解速率較快，隨后逐漸減緩。粗酶液用量由0.5%增加到2%時(shí)，降解率增加十分明顯，但粗酶液用量由2%增大到3%時(shí)，降解率增加幅度較小。稻草磨粉經(jīng)微波與堿聯(lián)合處理后，便于纖維素酶與纖維素結(jié)合，這是前24h水解速率較快的主要原因，但隨著水解的進(jìn)行及粗酶液用量的增大，能提供給酶結(jié)合的有效位點(diǎn)減少，因而降解率增幅減小。綜合生產(chǎn)成本等因素，采用2%(降解液體積比)粗酶液較為合適。

圖1 粗酶液用量對降解效率的影響Fig.1 Effect of crude enzyme dosage on efficiency of degradation

2.1.2 稻草粉濃度對降解的影響 控制初始pH5.5，溫度50℃，粗酶液用量2%，分別采用40、60、80、100、120g/L稻草粉進(jìn)行降解實(shí)驗(yàn)，反應(yīng)48h，分析稻草粉濃度對降解的影響，結(jié)果如圖2。

圖2 稻草粉濃度對降解的影響Fig.2 Effect of rice straw powder concentration on degradation

由圖2可見，隨著稻草粉濃度的增加，降解速率逐漸下降。發(fā)酵至48h時(shí)，稻草粉濃度由40g/L增加至100g/L，降解率下降幅度不大，而繼續(xù)增加稻草粉濃度至120g/L時(shí)，降解率的降幅十分明顯。發(fā)生這種現(xiàn)象的原因，可能是稻草粉濃度較大時(shí)，稻草粉不宜混勻，不利于纖維素酶與纖維素的充分接觸;同時(shí)可能是在高稻草粉濃度下產(chǎn)生的降解產(chǎn)物對降解過程產(chǎn)生了抑制作用［10］?？紤]到利用稻草粉降解液發(fā)酵檸檬酸時(shí)需要較高的還原糖濃度，因而需要適當(dāng)較高的稻草粉濃度［11］，所以選擇實(shí)驗(yàn)條件下稻草粉濃度為100g/L。

2.1.3 pH對降解的影響 控制溫度50℃，粗酶液用量2%，稻草粉濃度100g/L進(jìn)行降解實(shí)驗(yàn)，分別采用不同的初始pH，反應(yīng)48h，分析初始pH對降解的影響，結(jié)果如圖3。

從圖3可見，pH對稻草粉降解有顯著影響，在本實(shí)驗(yàn)條件下，pH4.5～5.5時(shí)，降解率可達(dá)70%以上，這與一般纖維素酶最適pH范圍一致。pH偏離此范圍增大或減小時(shí)，降解率都顯著下降，其中pH4.8時(shí)降解率可達(dá)最高。本實(shí)驗(yàn)用粗酶液中的纖維素酶是來源于兩種霉菌混合發(fā)酵液的復(fù)合酶系，顯然該酶系催化稻草粉糖化降解的最適pH為4.8，當(dāng)pH發(fā)生改變時(shí)，會(huì)改變酶系各基團(tuán)的解離狀態(tài)而影響酶分子活性中心的結(jié)構(gòu)，影響其與稻草纖維素分子結(jié)合與催化降解的能力，pH變化過大還會(huì)導(dǎo)致酶分子整體空間結(jié)構(gòu)的變化而減弱催化活性。

圖3 初始pH對稻草粉降解的影響Fig.3 Effect of initial pH value on degradation of straw powder

2.1.4 溫度對降解的影響 控制粗酶液用量2%，稻草粉濃度100g/L，初始pH4.8進(jìn)行降解實(shí)驗(yàn)，在不同溫度下反應(yīng)48h，分析溫度對稻草粉降解的影響，結(jié)果如圖4。

圖4 溫度對稻草粉降解的影響Fig.4 Effect of temperature on degradation of straw powder

由圖4可見，在反應(yīng)的前5h內(nèi)，較高溫度(55、60℃)下降解速率較高，但在此后，40～55℃條件下降解率隨時(shí)間而增大，特別是50℃時(shí)降解率增加最為明顯，而60℃條件下降解率增加變得十分緩慢，顯然50℃是此反應(yīng)條件下的最適溫度。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的可能原因是，在最適溫度以下時(shí)，隨溫度的升高降解反應(yīng)速率加快，而當(dāng)溫度超過了最適溫度，酶分子會(huì)大量變性而失活，使降解反應(yīng)減慢，溫度越高，酶變性越快，降解速率降低得也越快。在反應(yīng)初始階段，酶失活較少、而酶促反應(yīng)隨溫度的提高而加速;而當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行了一段時(shí)間后，較高溫度(60℃)下酶大量失活，使降解速率顯著降低。

2.2 優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表2。

表2 稻草粉降解正交實(shí)驗(yàn)方案與結(jié)果分析Table 2 Scheme of rice straw powder degradation by orthogonal test and result analysis

由表2可見，影響稻草粉降解為葡萄糖的各因素的主次順序?yàn)?粗酶液用量＞降解溫度＞pH＞稻草粉濃度，顯然粗酶液用量對稻草粉降解為葡萄糖影響最大，溫度的影響也較顯著，而稻草粉濃度與pH的重要性相近，均相對較小。經(jīng)結(jié)果分析可以確定，稻草粉降解為葡萄糖的最優(yōu)條件組合為:粗酶液用量為降解液總體積的3%，降解液初始稻草粉濃度60g/L，pH4.8，降解溫度50℃。經(jīng)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)測定，在此條件下的降解率為80%。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)用混合糖化菌纖維素酶活較強(qiáng)，稻草經(jīng)預(yù)處理后，有利于纖維素在混合菌產(chǎn)生的粗纖維素酶液作用下降解為葡萄糖。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，粗酶液用量是影響稻草粉降解為葡萄糖產(chǎn)率大小的最重要因素，其次是降解溫度，pH和稻草粉濃度對降解率的影響相對較小。利用木霉(T1)與曲霉(T3)在合適的條件下混菌發(fā)酵制得的粗酶液降解經(jīng)處理的稻草粉的優(yōu)化組合為:粗酶液用量為降解液總體積的3%，降解液初始稻草粉濃度60g/L，pH4.8，降解溫度50℃，在此條件下降解率達(dá)80%。粗酶液用量增加，降解得率會(huì)明顯提高，但過多地使用酶液會(huì)導(dǎo)致前期混菌發(fā)酵制備纖維素酶的工作量過大、成本增加，所以綜合考慮各種因素，可采用適當(dāng)較少的粗酶液用量，而適當(dāng)延長降解時(shí)間，也可提高降解率并獲得較高葡萄糖濃度。

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Study on the condition of straw cellulose degradation to produce glucose by m ixed culture

LIU Yi，YUAN Yue－h(huán)ua
(Biochemical Engineering Department of Hunan Mechanical＆Electrical Polytechnic，Changsha 410151，China)

In this research，a strain of trichoderm a and aspergillus filtered out from the environment was used to ferment in powder－liquid med ium where the main carbon source was rice straw.Along with the ferm entation，the p retreated rice straw powder was catalytic deg raded into g lucose by enzyme.There was orthogonal test based on sing le fac tor experim ent.The orthogonal experiment showed that the c rude enzyme liquid dosage caused the biggest influence on the degradation of straw powder，second was tem perature and followed by pH value，and the straw powder concentration caused the m inimum effects on deg radation.The op timal conditions of deg radation of rice straw powder was:the percentage of the volume of crude enzyme liquid in total deg radation liquid was 3%，initial straw powder concentration was 60g/L，the pH value was 4.8，the deg radation temperature was 50℃.Under the op tim al cond itions，the deg radation rate could be ab le to reach 80%.

m ixed culture;deg radation;rice straw;cellulose

TS201.3

A

1002－0306(2012)19－0191－03

2012－03－02

劉毅(1964－)，男，本科，副教授，研究方向:生物化工技術(shù)應(yīng)用。

湖南省科技廳科技計(jì)劃項(xiàng)目(2011FJ3131)。