李玉環(huán)，張 巖，時 威

(1.日照職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品工程學(xué)院，山東日照 276826;

2.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306;

3.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，廣東廣州 510300;

4.廣東海洋大學(xué)，廣東湛江 524088)

枯草芽孢桿菌HS18堿性蛋白酶分離純化及其性質(zhì)研究

李玉環(huán)1，張 巖2，3，時 威4

(1.日照職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品工程學(xué)院，山東日照 276826;

2.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306;

3.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，廣東廣州 510300;

4.廣東海洋大學(xué)，廣東湛江 524088)

從合浦珠母貝腸道中分離鑒定到酶菌株枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HS18，將枯草芽孢桿菌HS18的發(fā)酵液，經(jīng)過硫酸銨鹽析、DEAE－Sephadex A－50柱層析、Sephadex G－100柱層析3步純化后得到了單一的酶蛋白，回收率為11.4%;經(jīng)SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳測得酶蛋白分子量約為31ku;該蛋白酶最適反應(yīng)溫度為50℃，最適pH10.0;K+及Na+對酶有明顯激活作用;絲氨酸蛋白酶特異性抑制劑(PMSF)能強(qiáng)烈抑制酶活性。表明所純化到的蛋白酶為絲氨酸堿性蛋白酶。

合浦珠母貝，枯草芽孢桿菌HS18，堿性蛋白酶，分離純化，酶學(xué)性質(zhì)

堿性蛋白酶是在堿性pH范圍內(nèi)穩(wěn)定且具有活性的一類酶，屬內(nèi)肽酶中的絲氨酸蛋白水解酶類，是一類非常重要的工業(yè)用酶。由于微生物產(chǎn)生的蛋白酶為胞外酶，與動植物源蛋白酶相比具有很多優(yōu)點(diǎn):微生物資源來源廣、菌體培養(yǎng)簡單、酶產(chǎn)量高、高產(chǎn)菌株的選育相對簡單、微生物源蛋白酶價格低廉、易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化。此外堿性蛋白酶的水解能力、耐堿能力及耐熱性等性能要比其它蛋白酶強(qiáng)且具有明顯優(yōu)勢，因此，堿性蛋白酶研究成為蛋白酶研究的熱點(diǎn)［1］。目前，國內(nèi)外對堿性蛋白酶產(chǎn)生菌株的篩選主要集中在陸地微生物，而海洋微生物產(chǎn)堿性蛋白酶的研究卻相對較少［2］。與陸地的某些生態(tài)環(huán)境相比，海洋微生物由于長期在特殊的環(huán)境中生存進(jìn)化，往往能代謝生產(chǎn)結(jié)構(gòu)新穎、活性獨(dú)特的蛋白酶類［3］，近年來，越來越多的科研工作者開始把目光投向海洋環(huán)境，尋找和開發(fā)新型的微生物蛋白酶資源。本研究以從我國盛產(chǎn)海水珍珠的海南三亞陵水海域采集的合浦珠母貝為研究對象，從其腸道內(nèi)首次篩選得到具有分泌堿性蛋白酶的枯草芽孢桿菌菌株，并對其產(chǎn)酶學(xué)性質(zhì)和純化進(jìn)行初步研究，為其在食品加工以及其他行業(yè)中應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

枯草芽孢桿菌HS18 分離自合浦珠母貝腸道，合浦珠母貝采集自海南三亞陵水海域(3齡左右;健康珠貝，殼長8cm左右，殼寬3.5cm左右);Sephadex G－100、DEAE－Sepharose Sigma公司;標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量蛋白質(zhì) 上海生工生物工程服務(wù)有限公司; K2HPO4、KCl、MgSO4·7H2O，分析純 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

ULTRA－TURRAX? T25勻漿機(jī) 德國IKA; GENESYSTM5紫外－可見分光光度計(jì) 美國Thermo Spectronic;3K30高速冷凍離心機(jī) 德國 SIGMA; CHRIST冷凍干燥機(jī) 德國SIGMA;Mini Protean小型垂直電泳槽 德國 Bio－rad;貯酶冰箱 日本SANYO公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 枯草芽孢桿菌HS18粗酶液的制備［4］從斜面保存的枯草芽孢桿菌HS18挑取1環(huán)接種到裝有20m L經(jīng)1×105Pa滅菌20m in的種子培養(yǎng)基的50m L試管中，并在28℃下?lián)u床培養(yǎng)24h，同樣方法再活化一次。吸取1m L活化好的菌液，接種到裝有300m L并經(jīng)1×105Pa滅菌20min的產(chǎn)酶培養(yǎng)基的500m L三角瓶中，并在28℃下?lián)u床培養(yǎng)48h，發(fā)酵液經(jīng)8000r/min離心15min，收集上清液，即為粗酶液。

1.2.2 酶的分離純化

1.2.2.1 硫酸銨飽和度的選擇 根據(jù)硫酸銨溶液飽和度計(jì)算表［5］，在粗酶液添加硫酸銨，分別使終濃度為10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%，搖勻，4℃條件下靜置過夜，12000 r/min冷凍離心20m in，經(jīng)緩沖液透析后測上清液和沉淀酶活力。

1.2.2.2 柱層階分析［6］將透析脫鹽后的粗酶液棄沉淀上DEAE－Sephadex A－50陰離子交換柱(15cm ×30cm)，用50mmol/L pH7.2 Tris－HCl緩沖液及含不同濃度氯化鈉的Tris－HCl緩沖液，進(jìn)行梯度洗脫，紫外檢測器在波長280nm處檢測吸收峰，測定蛋白質(zhì)含量和酶活力;將DEAE－Sephadex A－50得到的活性組分上Sephadex G－100柱(2.8cm×104cm)進(jìn)行層析，紫外檢測器在波長280nm處檢測吸收峰，測定蛋白質(zhì)含量和酶活力，收集酶活性峰后用70%硫酸銨溶液濃縮。收集的酶活性部進(jìn)行SDS－PAGE電泳檢測酶純度及用于酶學(xué)性質(zhì)的研究。

1.2.3 酶活力測定 取1m L酶液在40℃預(yù)熱4m in然后加入40℃預(yù)熱4m in的1m L 2%酪蛋白溶液，混合，40℃反應(yīng)10m in，再加2m L 0.4mol/L三氯乙酸終止反應(yīng)。從水浴中取出靜止10m in后12000 r/m in離心20min，然后吸取上清液1m L加5m L 0.4mol/L碳酸鈉溶液，再加 1m L Folin試劑，40℃水浴孵化15m in，冷卻后于660nm處測定其OD值［7］。對照實(shí)驗(yàn):先向1m L酶液中加入2m L 0.4mol/L三氯乙酸溶液，然后加入2%酪蛋白溶液。其余步驟同上。以上均重復(fù)3次，取其平均值。1m L酶液在一定溫度和pH條件下，每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1μg酪氨酸的酶量為一個酶活力單位，以U表示。

1.2.4 酶學(xué)性質(zhì)的初步研究

1.2.4.1 酶作用的最適溫度 在20、30、40、50、60、70、80℃恒溫水浴條件下，將1m L酶液與1m L 2%酪蛋白溶液分別孵化10min后，按1.2.3方法分別測定蛋白酶活力。

1.2.4.2 酶作用的最適pH 用pH為2～12的緩沖液配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的酪素分別與以相應(yīng)緩沖液稀釋的酶液混合，按1.2.3方法測定蛋白酶活力。

1.2.4.3 金屬離子、蛋白酶抑制劑對酶活力的影響取適當(dāng)稀釋的酶液，向其中分別加入用蒸餾水配制一定濃度的金屬鹽溶液及蛋白酶抑制劑，40℃保溫60m in后，按1.2.3方法測定蛋白酶活力。以不加金屬鹽溶液及蛋白酶抑制劑做對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶的分離純化

2.1.1 硫酸銨飽和度的選擇 由圖1可知，當(dāng)硫酸銨飽和度小于30%時，上清液的酶活力基本上保持不變，沉淀的相對酶活力也微乎其微，說明硫酸銨飽和度小于30%時不能鹽析出蛋白或者析出的蛋白是雜蛋白，基本上不能析出目的蛋白;當(dāng)硫酸銨飽和度在30%～70%時，上清液的相對酶活力迅速下降，相反沉淀的酶活力迅速上升，可知當(dāng)硫酸銨飽和度在30%～70%時目的蛋白酶被逐漸鹽析出來;當(dāng)硫酸銨飽和度大于70%時上清液和沉淀的酶活力基本上趨于平衡，說明當(dāng)硫酸銨飽和度大于70%時鹽析出的蛋白基本上是雜蛋白。綜上可知可以先用飽和度為30%硫酸銨鹽析去除雜蛋白，然后向上清液中補(bǔ)加硫酸銨使飽和度達(dá)到70%進(jìn)而來鹽析目的蛋白，這樣通過分級沉淀可以獲得更好的目的蛋白提取率。

圖1 蛋白酶的分級鹽析Fig.1 Precipitation of protease by ammonium sulfate

2.1.2 DEAE－Sephadex A－50柱層析 由圖2可知，枯草芽孢桿菌HS18培養(yǎng)上清液經(jīng)硫酸銨分級沉淀、溶解及透析后得到的粗酶，經(jīng)DEAE－Sephadex A－50柱層析，紫外檢測器在波長280nm處檢測得到3個吸收峰。測定3個吸收峰蛋白質(zhì)含量和酶活力，可知第1個洗脫峰(9～20號管)和第 2個洗脫峰(21～35號管)基本沒有酶活力，酶活力主要集中在第3個洗脫峰(44～59號管)。將活性峰洗脫液收集，用70%硫酸銨溶液沉淀濃縮，備用。

2.1.3 Sephadex G－100柱層析 由圖3可知，DEAE－Sephadex A－50離子交換層析獲得的活性組分，經(jīng)Sephadex G－100凝膠過濾后共分離出3個峰，通過酶活檢測知道第1個洗脫峰(10～23號管)是活性峰。收集活性峰，將其用70%硫酸銨溶液沉淀濃縮，以待SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。

表1 枯草芽孢桿菌HS18蛋白酶的純化Table 1 Purification of Bacillus subtilis HS18 protease

圖2 DEAE－Sephadex A－50柱層析Fig.2 DEAE－Sephadex A－50 column chromatography

圖3 Sephadex G－100柱層析Fig.3 Sephadex G－100 gel filtration

2.1.4 SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳 SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳獲得單一條帶(見圖4)，這表明純化效果較好，該酶樣已達(dá)到電泳純，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白計(jì)算可得該酶的分子量約為31ku?？赡苡捎谠摰鞍酌妇哂惺杷裕?℃濃縮過程中會逐漸析出呈樹葉狀蛋白酶晶體。蛋白酶的分離純化結(jié)果見表1。由表1可知，經(jīng)過鹽析、DEAE－Sephadex A－50柱層析、Sephadex G－100柱層析3步純化后酶的比活力明顯提高，蛋白酶樣品比活力達(dá)到4960.8U/mg，回收率11.4%。

圖4 純化酶樣品SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳圖Fig.4 SDS－PAGE pattern of purified protease

2.2 酶的性質(zhì)

2.2.1 酶的最適反應(yīng)溫度 由圖5可知，當(dāng)溫度小于50℃時，蛋白酶活力隨著溫度的升高，其活力呈上升趨勢;當(dāng)溫度大于50℃時蛋白酶活力迅速下降。在40～55℃范圍內(nèi)蛋白酶具有較高活力，其最適反應(yīng)溫度為50℃。

圖5 酶作用的最適溫度Fig.5 The optimum temperature of protease

2.2.2 酶的最適反應(yīng)pH 由圖6可知，在pH10.0以下時蛋白酶相對酶活力隨著pH的升高而迅速升高，當(dāng)pH10.0以上時蛋白酶相對酶活力開始下降。其中蛋白酶在pH8.0～12.0時有較高的相對酶活力，蛋白酶最適pH為10.0。綜上可知，該蛋白酶具有典型的堿性蛋白酶特征［8－9］，與所報(bào)道的枯草芽孢桿菌蛋白酶最適pH一致［7］，因此該蛋白酶屬堿性蛋白酶。

圖6 酶作用的最適pHFig.6 The optimum pH of protease

2.2.3 金屬離子、蛋白酶抑制劑對酶活力的影響從表2可見，1mmol/L的ZnSO4、FeSO4、MgCl2可以抑制20%～45%的酶活性，說明Zn2+、Fe2+、Mg2+對酶具有較強(qiáng)的抑制作用;1mmol/L的NaCl和KCl可以使酶的活力顯著提高，說明K+和Na+對蛋白酶活力起激活作用，能顯著提高蛋白酶活力，其中K+的激活作用最強(qiáng)，可以使酶活性提高31%左右。初步推測，K+在酶的活性中心結(jié)構(gòu)方面具有一定的功能。金屬酶抑制劑EDTA對該蛋白酶基本上沒有抑制作用，說明該蛋白酶基本上不含有Ca2+，表明Ca2+對該蛋白酶沒有激活作用，這與1mmol/L的CaCl2的殘余相對酶活力相符;絲氨酸蛋白酶特異性抑制劑PMSF幾乎完全抑制該蛋白酶活力，剩余酶活僅4%，推測該蛋白酶可能為絲氨酸堿性蛋白酶。

表2 金屬離子、蛋白酶抑制劑對酶活力的影響Table 2 Effect of variousmetal ions and protease inhibitors on proteas activity

3 結(jié)論

通過鹽析、離子交換層析、凝膠過濾分離純化了由菌種枯草芽孢桿菌HS18發(fā)酵所產(chǎn)的蛋白酶，經(jīng)測定，純化后蛋白酶總活力為38694U，蛋白酶比活力為4960.8U/mg，回收率為11.4%;經(jīng)SDS－PAGE電泳獲得單一條帶，根據(jù)電泳圖可知其分子質(zhì)量約為31ku; K+及Na+對酶有明顯激活作用;絲氨酸蛋白酶特異性抑制劑(PMSF)能強(qiáng)烈抑制酶活性;對蛋白酶的酶學(xué)特性研究表明，蛋白酶最適反應(yīng)溫度為50℃，最適pH為10.0，以上結(jié)果表明所純化到的蛋白酶可能為絲氨酸堿性蛋白酶。目前國內(nèi)關(guān)于從海洋環(huán)境中分離的芽孢桿菌產(chǎn)該堿性蛋白酶的報(bào)道較少［1，10］，結(jié)合相關(guān)報(bào)道及本研究成果，表明海洋環(huán)境芽孢桿菌所得的堿性蛋白與陸地源芽孢桿菌產(chǎn)堿性蛋白酶相比具有性質(zhì)穩(wěn)定等特點(diǎn)。2009年王雪梅等［10］從南海海底沉積物中分離到一株產(chǎn)堿性蛋白酶的枯草芽孢桿菌，其最適酶活溫度達(dá)60℃，本研究所得的堿性蛋白酶最適酶活溫度達(dá)50℃，而陸地源芽孢桿菌所產(chǎn)的堿性蛋白酶最適酶活溫度僅在40～45℃［4，11－12］，這可能由于惡劣海洋的環(huán)境，往往能代謝產(chǎn)生性質(zhì)更加穩(wěn)定的蛋白酶類。本研究從海洋生物合浦珠母貝的腸道中分離得到產(chǎn)堿性蛋白酶的枯草芽孢桿菌HS18，突破了以往主要從陸生動物中分離培養(yǎng)產(chǎn)堿性蛋白酶的菌株，拓展了堿性蛋白酶的原料來源。

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Separation and purification of alkaline protease and its properties from Bacillus subtilis HS18

LIYu－h(huán)uan1，ZHANG Yan2，3，SH IW ei4
(1.Food Engineering College，Rizhao Polytechnic，Rizhao 276826，China;
2.College of Food Science of Shanghai Ocean University，Shanghai201306，China;
3.South China Sea Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences，Guangzhou 510300，China;
4.Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088，China)

The p rotease p roduced by the fermentation of strain HS18，which isolated from the intestinal of Pinctada martensi and identified as Bacillus subtilis.A p rotease with high purity from the fermentation of Bacillus sub tilis HS18 was purified by p recip itation w ith ammonium sulfate，DEAE－Sephadex A－50column chromatography and Sephadex G－100 gel filtration chrom atog raphy and its recovery rate was 11.4%.The p rotease was determ ined by SDS－PAGE to have a molecular weight of 31ku.The op timal pH and tem perature of the p rotease were 10.0 and 50℃，respec tively.In add ition，this p rotease could be ac tivated by d ivalent cations such as K+and Na+and inhibited by serine－p rotease inhibitors(PMSF).All results showed that this alkaline p rotease was a serinep rotease.

Pinctada martensi;Bacillus subtilis;alkaline p rotease;separation and purification;enzymatic p roperties

TS201.3

A

1002－0306(2012)19－0187－04

2012－02－14

李玉環(huán)(1969－)，女，副教授，主要從事食品生物技術(shù)、水產(chǎn)品加工與綜合利用及水產(chǎn)品安全性研究。

海南省重點(diǎn)科技項(xiàng)目(ZDXM20100005);廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2011B031200009)。