陳鴻勝，李克非，舒行宙，劉 瀏，林金萍，魏東芝

(華東理工大學(xué)，生物反應(yīng)器國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，魯華生物技術(shù)研究所，上海 200237)

基于Gluconobacter oxydans膜結(jié)合脫氫酶的靜息細(xì)胞催化合成2-酮基-D- 葡萄糖酸

陳鴻勝，李克非，舒行宙，劉 瀏，林金萍*，魏東芝

(華東理工大學(xué)，生物反應(yīng)器國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，魯華生物技術(shù)研究所，上海 200237)

基于G.oxydans DSM2003膜結(jié)合葡萄糖酸－2－脫氫酶(GA－2－DH)的催化特性，利用靜息細(xì)胞催化技術(shù)合成D－異抗壞血酸(EA)的主要前體2－酮基－D－葡萄糖酸(2－KGA)。利用高濃度底物自適應(yīng)篩選技術(shù)，篩選到高產(chǎn)2－KGA菌株并對(duì)其搖瓶催化進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后最適條件為:溫度30℃，pH6.0，細(xì)胞濃度20g/L，底物濃度1100mmol/L，搖床轉(zhuǎn)速250r/min，此時(shí)時(shí)空產(chǎn)率為24.68mmol/L/h;搖瓶優(yōu)化工藝基礎(chǔ)上在7L發(fā)酵罐中對(duì)重點(diǎn)影響參數(shù)(轉(zhuǎn)速與底物濃度)進(jìn)行了進(jìn)一步優(yōu)化，優(yōu)化后2－KGA的時(shí)空產(chǎn)率提高到74mmol/L/h，并且催化細(xì)胞可有效重復(fù)利用3次。

2－KGA，氧化葡萄糖酸桿菌，靜息細(xì)胞催化，工藝優(yōu)化

氧化葡萄糖酸桿菌具有豐富的膜結(jié)合與胞內(nèi)氧化系統(tǒng)、不完整的TCA循環(huán)以及缺失的糖酵解途徑，使其能夠?qū)⒍喾N糖、醇以及醛類物質(zhì)不完全氧化合成相應(yīng)的產(chǎn)物［1］。而其基于結(jié)合酶的反應(yīng)更是具有反應(yīng)快分離容易等特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于食品以及化工品合成等行業(yè)，如(R)－β－羥基異丁酸［2］合成等。2－酮基－D－葡萄糖酸(2－KGA)是目前大規(guī)模生產(chǎn)的一種有機(jī)酸，被廣泛應(yīng)用于合成D－異抗壞血酸(鈉) (EA/EN);EA作為肉類、水果、飲料等食品中可代謝抗氧化劑可以有效地減少食品的氧化，防止其色、香、味褪變，抑制食品中致癌物質(zhì)亞硝酸鹽的生成，其防腐效果大大超過維生素C，而價(jià)格不到維生素C的二分之一，有很好的應(yīng)用前景［3－4］。另外，2－KGA還可以用來合成有機(jī)糖(酸)及其衍生物，如樹膠醛醣、核酮糖、羥基丙二酸［5］、醛基糖酸［6］以及氨基糖［7］等;可以作為顯影劑、動(dòng)物飼料添加劑、除草添加劑［8］以及建筑水泥行業(yè)增塑劑［9］。目前，2－KGA的合成方法主要有 3種:化學(xué)合成法［10］、酶法［11］和發(fā)酵法［12］，其中以熒光假單胞桿菌發(fā)酵法為實(shí)際生產(chǎn)中最主要的合成工藝［3］，過程中時(shí)空產(chǎn)率高達(dá)6.22g/L/h(32mmol/L/h)，平均發(fā)酵轉(zhuǎn)化率為89%［13］。本文根據(jù)G.oxydans具有的膜結(jié)合葡萄糖酸－2－脫氫酶(GA－2－DH)可氧化葡萄糖酸(GA)生成2－KGA的特性，建立了靜息細(xì)胞催化法合成2－KGA的工藝。主要考察了影響催化效率的關(guān)鍵因素，并進(jìn)行了重復(fù)利用靜息細(xì)胞多批次轉(zhuǎn)化合成2－KGA的研究，為2－KGA的生物合成開拓了一條新的潛在生產(chǎn)途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

2－KGA、5－KGA Sigma－A ldrich;葡萄糖酸鈉(GA) 上?？ú┕べQ(mào)有限公司;G.oxydans#3 (DSM2003)及其篩選菌株G.oxydans#3A 均由華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保藏。

恒溫培養(yǎng)搖床 上海Shenergy Biocolor公司;恒溫轉(zhuǎn)化搖床 上海華利達(dá)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;7L發(fā)酵罐 上海保興生物設(shè)備工程有限公司;高效液相色譜檢測系統(tǒng) 美國安捷倫公司。

1.2 菌株培養(yǎng)與篩選

1.2.1 培養(yǎng)基成分 液體山梨醇培養(yǎng)基:8%山梨醇，2%酵母粉，0.1%KH2PO4，0.05%MgSO4·7H2O，0.01%L－Glutamine;液體 GA培養(yǎng)基:10%～30% GA，1%葡萄糖，2%酵母粉，0.1%KH2PO4，0.05% MgSO4·7H2O，0.01%L－Glutam ine;在液體培養(yǎng)基加入1.5%瓊脂即得固體培養(yǎng)基。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及自適應(yīng)篩選 將菌從甘油管或者平板培養(yǎng)基上移接至液體培養(yǎng)基進(jìn)行一級(jí)種子培養(yǎng)24h，接著以10%接種量接至下級(jí)培養(yǎng)基中，于30℃(發(fā)酵罐pH控制在5.8～6.0)條件下培養(yǎng)22h。高濃度GA液體(固體)培養(yǎng)基培養(yǎng)菌體，使其通過自適應(yīng)的方式得到篩選。

1.3 搖瓶小型轉(zhuǎn)化及發(fā)酵罐放大

菌體培養(yǎng)液離心得到靜息細(xì)胞，稱取一定量該菌體細(xì)胞加入至裝有20m L GA底物溶液的150m L三角瓶中，pH調(diào)至實(shí)驗(yàn)值，置于30℃的恒溫?fù)u床中反應(yīng)。放大實(shí)驗(yàn)在7L發(fā)酵罐中進(jìn)行，反應(yīng)基本條件為30℃，pH5.0。

1.4 檢測方法

利用 ICE－COREGEL 87H3高效液相色譜柱(Transgenom ic，Inc.)進(jìn)行檢測，檢測條件為:流動(dòng)相為0.008N的硫酸溶液、流速0.6m L/m in、柱溫35℃、進(jìn)樣量10μL，GA、2－KGA、5－KGA能夠得到有效地分離，保留時(shí)間分別為8.6、7.8、8.2m in。

1.5 最終轉(zhuǎn)化率的計(jì)算

2 結(jié)果與分析

醋酸桿菌科(特別是氧化葡萄糖酸桿菌屬)微生物能通過膜結(jié)合脫氫酶GA－2－DH與GA－5－DH將GA分別氧化成2－KGA和5－KGA，但不同的菌株以及培養(yǎng)基條件，產(chǎn)生2－KGA與5－KGA的量有所不同［14］。本實(shí)驗(yàn)以實(shí)驗(yàn)室保藏的一株G.oxydans#3為出發(fā)菌株，以GA為底物，分別通過發(fā)酵法和靜息細(xì)胞催化法合成2－KGA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)發(fā)酵體系中同時(shí)產(chǎn)生了2－KGA和5－KGA，但以2－KGA為主;而在靜息細(xì)胞催化GA的過程中，卻只檢測到2－KGA的產(chǎn)生，沒有5－KGA產(chǎn)生，實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)物的100%選擇性合成，因此本研究確定了靜息細(xì)胞催化法合成2－KGA的工藝。

2.1 高產(chǎn)2－KGA菌株的篩選

為了篩選耐高濃度GA并高產(chǎn)2－KGA的菌株，實(shí)驗(yàn)中首先將出發(fā)菌株G.oxydans#3在含有不同濃度梯度GA的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，利用其對(duì)生長環(huán)境的自適應(yīng)進(jìn)化，提高菌株的底物耐受性，并誘導(dǎo)其目的酶的過表達(dá)，從而獲得了一株2－KGA產(chǎn)率明顯提高的進(jìn)化菌株G.oxydans#3A。圖1和圖2分別顯示了原始菌與進(jìn)化菌的生長情況和催化合成2－KGA的比較。從圖1可以看出，G.oxydans#3A的生長趨勢(shì)與G.oxydans#3基本相似，在20h時(shí)取樣檢測發(fā)現(xiàn)前者的菌體得率(單位體積培養(yǎng)液菌體量)為10.7g/L略高于后者的10g/L。而從圖2中可以發(fā)現(xiàn)，G.oxydans #3A在48h就能將440mmol/LGA完全消耗，而原始菌則需要60～72h，這表明在高濃度GA的自適應(yīng)過程中，負(fù)責(zé)合成2－KGA的關(guān)鍵酶GA－2－DH的表達(dá)水平或者活性可能得到提高，從而在催化GA合成2－KGA的過程中表現(xiàn)出更高的轉(zhuǎn)化效率。

圖1 原始菌與進(jìn)化菌的生長曲線比較Fig.1 Growth curves of initial strain and improved atrain

圖2 原始菌與進(jìn)化菌催化合成2－KGA活力比較Fig.2 Comparison of 2－KGA productivity of G.oxydans#3 and G.oxydans#3A

2.2 細(xì)胞菌體培養(yǎng)時(shí)間與細(xì)胞活性的關(guān)系

細(xì)胞中酶的表達(dá)通常受到菌體生長周期的影響，因此細(xì)胞的收集時(shí)間可能對(duì)其催化活性很關(guān)鍵。實(shí)驗(yàn)中在菌體生長的不同時(shí)間點(diǎn)取出20～50m L培養(yǎng)液，離心后獲取靜息細(xì)胞，測定其合成2－KGA的初速度(即前5h的平均速度)結(jié)果如圖3所示。在菌體培養(yǎng)初期3h與6h(延遲期到對(duì)數(shù)期初期)，細(xì)胞催化GA合成2－KGA的能力相對(duì)較弱，其催化初速度在9.0～10mmol/L/h;隨著菌體的快速增殖，靜息細(xì)胞的催化活性顯著提高，生長到12h時(shí)細(xì)胞的催化活性達(dá)到最高值15.5mmol/L/h，之后獲取得到的靜息細(xì)胞的催化活性基本維持不變，而進(jìn)入衰亡期的細(xì)胞的催化活性會(huì)有微弱的下降。關(guān)聯(lián)圖1可以發(fā)現(xiàn)，對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞表現(xiàn)最高的GA催化活性，因此為了能在具有最高細(xì)胞催化活性的同時(shí)獲得盡可能多靜息細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)選擇培養(yǎng)21～22h(細(xì)胞對(duì)數(shù)生長期末)獲得的靜息細(xì)胞作為催化劑來催化合成2－KGA。

2.3 搖瓶中催化合成2－KGA的條件優(yōu)化

2.3.1 溫度對(duì)靜息細(xì)胞催化活性的影響 靜息細(xì)胞催化過程中，體系的溫度會(huì)通過酶活以及底物與溶氧的傳質(zhì)來影響合成2－KGA的效果。氧化葡萄糖酸桿菌中GA－2－DH最適溫度與其他大多數(shù)的膜結(jié)合酶相似，在30℃左右［15］，當(dāng)然也有某些特殊的氧化葡萄糖酸桿菌菌株溫度可達(dá)37℃，甚至更高［16］。所以實(shí)驗(yàn)中對(duì)不同溫度進(jìn)行了考察，結(jié)果如表1所示，可以發(fā)現(xiàn)靜息細(xì)胞催化過程控溫在30℃，細(xì)胞有較好的轉(zhuǎn)化效果。

表1 不同溫度對(duì)靜息細(xì)胞催化合成2－KGA的影響Table 1 The effect of temperature on the 2－KGA production by resting cells

表2 不同pH對(duì)靜息細(xì)胞催化合成2－KGA的影響Table 2 The effect of pH on the 2－KGA production by resting cells

表3 不同靜息細(xì)胞濃度對(duì)催化合成2－KGA的影響Table 3 The effect of concentration of resting cells on the 2－KGA production

圖3 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)靜息細(xì)胞催化活性的影響Fig.3 The effect of incubation time on the activity of resting cells

2.3.2 pH對(duì)靜息細(xì)胞催化活性的影響 文獻(xiàn)報(bào)道，G.oxydans中的酶GA－2－DH通常在酸性環(huán)境下表現(xiàn)較好的活性;對(duì)于某些氧化葡萄糖酸桿菌在催化GA或葡萄糖時(shí)，生成2－KGA與5－KGA比例也受pH的影響［14］。因此實(shí)驗(yàn)考察了不同 pH的反應(yīng)體系中2－KGA的生成情況，結(jié)果如表2所示。

不同pH條件下G.oxydans#3A催化GA合成2－KGA的效率差異較為明顯，pH4.5～6.0之間，GA的轉(zhuǎn)化效率和2－KGA的產(chǎn)量最高，而在pH5.0時(shí)產(chǎn)物的時(shí)空產(chǎn)率最高。反應(yīng)體系的pH低于4.0或高于6.0，都不利于催化反應(yīng)的進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)所得到最適pH與Ano以及Shinagawa等人所報(bào)道的GA－2－DH最適pH較為相似［17］。

2.3.3 細(xì)胞濃度對(duì)靜息細(xì)胞催化活性的影響 實(shí)驗(yàn)在底物GA濃度1100mmol/L(242g/L)條件下對(duì)細(xì)胞濃度進(jìn)行優(yōu)化。從表3看出反應(yīng)體系中菌體含量在10g/L增至15g/L時(shí)，反應(yīng)的速度也隨著增大，但是當(dāng)細(xì)胞繼續(xù)增加至30g/L時(shí)，細(xì)胞合成2－KGA的效果反而變差，這可能由于:細(xì)胞過多造成底物傳質(zhì)利用效率的變差;氧傳質(zhì)變差以及過多細(xì)胞需要大量的氧，造成局部缺氧甚至菌體自溶，這嚴(yán)重影響催化效率以及自溶引起的胞內(nèi)物釋放造成下游分離壓力加大。因此，實(shí)驗(yàn)選擇20g/L作為最優(yōu)的菌體濃度。

2.3.4 底物濃度對(duì)靜息細(xì)胞催化活性的影響 反應(yīng)體系中底物濃度過高可能會(huì)引起底物抑制，減慢底物的利用速率，而且可能由于一定時(shí)間內(nèi)底物不能被完全轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物，從而以“副產(chǎn)物”形式存在于催化終體系中，造成資源浪費(fèi)和下游分離難度加大，特別是對(duì)GA與2－KGA這樣分離較為困難的反應(yīng)，因此一個(gè)較為理想的底物濃度對(duì)于催化的高效性與實(shí)效性有著一定的意義。表4可以看出搖瓶催化體系中底物濃度為1100mmol/L時(shí)，催化效果相對(duì)較優(yōu)。另外，通過流式細(xì)胞檢測技術(shù)(檢測圖譜未給出)對(duì)各個(gè)底物濃度條件下催化36h后的菌體形態(tài)進(jìn)行檢測，可以發(fā)現(xiàn)隨著體系中底物濃度的增大，靜息細(xì)胞受到的損傷越大，細(xì)胞形態(tài)維持越差。

2.3.5 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)于靜息細(xì)胞催化活性的影響 氧化葡萄糖酸桿菌是一類嚴(yán)格好氧微生物，溶氧對(duì)催化反應(yīng)非常關(guān)鍵，這主要是由于GA氧化合成2－KGA時(shí)脫下的［H］的受體是氧，反應(yīng)體系中溶解氧濃度決定了反應(yīng)的速率與底物的投料量。在搖瓶催化體系中，溶氧很大部分受到搖床轉(zhuǎn)速的影響，因此實(shí)驗(yàn)中對(duì)搖床轉(zhuǎn)速進(jìn)行了考察，從表5可以看出，適當(dāng)?shù)奶岣邠u床轉(zhuǎn)速可增加2－KGA的時(shí)空產(chǎn)率。但當(dāng)轉(zhuǎn)速提高到300 r/m in時(shí)，由于轉(zhuǎn)速太快體系中形成明顯漩渦狀，甚至反應(yīng)液會(huì)被甩出反應(yīng)瓶，反而不利于溶氧與傳質(zhì)，反應(yīng)效果變差。

表4 不同底物GA濃度對(duì)催化合成2－KGA的影響Table 4 The effect of GA concentration on the 2－KGA production by resting cells

表5 不同搖床轉(zhuǎn)速對(duì)催化合成2－KGA的影響Table 5 The effect of rotation speed on the 2－KGA production by resting cells

因此，通過上述搖瓶中的單因素考察，在30℃、pH5.0、細(xì)胞濃度20g/L、底物濃度1100mmol/L、搖床轉(zhuǎn)速250r/min的優(yōu)化條件下，催化過程最大時(shí)空產(chǎn)率達(dá)到31.63mmol/L/h，平均時(shí)空產(chǎn)率為24.68mmol/L/h，轉(zhuǎn)化率在97%以上。

2.4 7L反應(yīng)器上規(guī)模放大以及工藝優(yōu)化

搖瓶實(shí)驗(yàn)存在傳質(zhì)以及溶氧供應(yīng)方面的劣勢(shì)，其轉(zhuǎn)化效率相對(duì)較低，為了更好的研究以及提高G.oxydans#3A對(duì)于催化GA合成2－KGA的能力，實(shí)驗(yàn)在7L發(fā)酵罐中對(duì)影響催化效果的關(guān)鍵因素(溶氧、底物濃度)進(jìn)行了進(jìn)一步優(yōu)化，結(jié)果如圖4與圖5所示。

圖4 發(fā)酵罐攪拌速度對(duì)合成2－KGA的影響Fig.4 The effect of stirring speed on the prodution in the fermentor

圖5 發(fā)酵罐中不同底物濃度對(duì)合成2－KGA的影響Fig.5 The effect of concentration of GA on 2－KGA the 2－KGA prodution in the fermentor

在轉(zhuǎn)速考察過程中，由于合成2－KGA反應(yīng)需氧量很大，實(shí)驗(yàn)中將通氣開到最大值8L/min。從圖4可以看出隨著轉(zhuǎn)速的提高，催化效果顯著改善，在650 r/m in轉(zhuǎn)速條件下，14±1h內(nèi)G.oxydans#3A靜息細(xì)胞基本將1100mmol/L的GA完全轉(zhuǎn)化為2－KGA，時(shí)空轉(zhuǎn)化率達(dá)73mmol/L/h，而相同細(xì)胞量搖瓶催化則需要44h;而當(dāng)轉(zhuǎn)速繼續(xù)提高，溶氧并沒有進(jìn)一步上升，而催化效果也沒有進(jìn)一步提高，反而在攪拌體系中央容易形成真空圈，機(jī)械剪切對(duì)細(xì)胞的損傷也變大，不利于細(xì)胞的重復(fù)利用，因此在7L發(fā)酵罐中，初步確定較理想的攪拌速度為650 r/m in。

由于溶氧以及傳質(zhì)的改善，實(shí)驗(yàn)對(duì)底物也進(jìn)行了進(jìn)一步優(yōu)化，根據(jù)化學(xué)反應(yīng)過程的動(dòng)力學(xué)原理可知r［P］=k×C［S1］×C［S2］，底物濃度越大產(chǎn)物合成的速率越快。但由圖5可以看出，本實(shí)驗(yàn)中葡萄糖濃度在1375～1835mmol/L時(shí)，合成2－KGA的速率隨著底物濃度的提高反而減小，這主要是由于底物濃度不合適地增大造成溶氧情況與底物傳質(zhì)相對(duì)低濃度較差，而且在高密度、高滲透壓與高粘度的溶液中，靜息細(xì)胞菌體在高速攪拌下容易破碎失活，在1835mmol/L濃度條件下表現(xiàn)最為明顯，經(jīng)過48h催化后的細(xì)胞顏色變成褐紅色，離心后的菌體變成絮團(tuán)狀，因此將較優(yōu)濃度設(shè)為1375mmol/L。

2.5 G.oxydans#3A靜息細(xì)胞在7L發(fā)酵罐上的重復(fù)利用

在 30℃、pH5.0、細(xì)胞濃度 20g/L、底物濃度1375mmol/L、攪拌速度 650 r/m in條件下進(jìn)行G.oxydans轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，每次轉(zhuǎn)化反應(yīng)結(jié)束(當(dāng)溶氧開始急速上升時(shí))，離心收集細(xì)胞進(jìn)行下一輪催化反應(yīng)。根據(jù)圖6顯示，反應(yīng)在前3批中均顯示很好的重復(fù)性，催化活性能保持在上一批95%以上，但是在進(jìn)行到第4批時(shí)，由于靜息細(xì)胞長時(shí)間暴露在高滲透環(huán)境以及較高機(jī)械剪切的情況下，導(dǎo)致細(xì)胞破裂加劇，離心得到的細(xì)胞僅為第三批的80%左右，反應(yīng)體系氣泡異常嚴(yán)重影響溶氧，細(xì)胞的催化活性開始顯著下降，因此目前反應(yīng)有效批次為3批，2－KGA時(shí)空產(chǎn)率達(dá)到67.5～74.0mmol/L/h。

圖6 7L發(fā)酵罐上靜息細(xì)胞催化GA合成2－KGA的批次研究Fig.6 The repeated utilization of resting cells to produce 2－KGA from GA in 7L fermentor

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)已篩選得到的一株高產(chǎn)2－KGA的菌株G.oxydans#3A，建立了靜息細(xì)胞催化法合成2－KGA的工藝路線。在30℃，pH5.0，細(xì)胞濃度20g/L，底物濃度1365mmol/L條件下，底物轉(zhuǎn)化率在97%以上，2－KGA時(shí)空產(chǎn)率高達(dá)74mmol/L/h，細(xì)胞能夠有效重復(fù)利用3次。這一路線是2－KGA的生物合成中發(fā)酵法之外的另一條高濃度合成2－KGA的高效工藝路線，而且可以一定意義上解決目前發(fā)酵法中存在的主要問題:a.噬菌體污染問題沒有從根本上得到解決;b.發(fā)酵體系中含有各種復(fù)雜的細(xì)胞分泌物，大大增加了下游產(chǎn)品分離、純化與結(jié)晶的工藝。

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High－yield production of 2－keto－D－gluconate by resting cells of G luconobacter oxydans

CHEN Hong－sheng，LIKe－fei，SHU Xing－zhou，LIU Liu，LIN Jin－ping*，WEIDong－zhi
(New World Biotechnology Institute，State Key Laboratory of Bioreactor Engineering，East China University of Science＆Technology，Shanghai200237，China)

Resting cells of G.oxydans DSM2003 is used to p roduce the 2－keto－g luco－nate，which is a p rimary p recursor for the synthesis of D－erythoribic acid(EA).One bacterium with high－yield p roduction capacity was obtained by self－adap ting to the high concentration of substrate，and the conversion rate had reached 24.68mmol/L/h in flask(tem perature at 30℃，pH at 6.0，cell concentration at 20g/L，substrate concentration at 1100mmol/L，shaking rate at 250r/m in).While catalysis was carried in the 7L fermentor under the op timum cond ition，the conversion rate of 2－KGA could reach 74mm ol/L/h and the cell could be reused effec tively for three tim es.

2－KGA;Gluconobacter oxydans;resting cell catalysis;p rocess op tim ization

TS201.3

A

1002－0306(2012)19－0177－05

2012－03－19 *通訊聯(lián)系人

陳鴻勝(1987－)，男，碩士，研究方向:生物催化合成工藝。

國家863重點(diǎn)項(xiàng)目(2011AA02A213)。