劉珊珊，單 藝，滿朝新，謝鯤昊，盧 雁，胡惠秩，閻天文，姜毓君，，*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱 150030;2.國(guó)家乳業(yè)工程技術(shù)研究中心，黑龍江哈爾濱 150086)

高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)法測(cè)定原料乳中的舒巴坦

劉珊珊1，單 藝2，滿朝新2，謝鯤昊1，盧 雁2，胡惠秩1，閻天文1，姜毓君1，2，*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱 150030;2.國(guó)家乳業(yè)工程技術(shù)研究中心，黑龍江哈爾濱 150086)

建立了利用高效液相色譜-二極管陣列法（high-performance liquid chromatography-photodiode array，HPLC-PDA)測(cè)定原料乳中舒巴坦含量的方法。采用C18色譜柱，以5.44g/L磷酸二氫鉀溶液（pH5.0)-乙腈（95∶5)為流動(dòng)相，流速為lmL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)220nm，柱溫30℃。樣品經(jīng)乙腈提取、乙酸鋅沉淀蛋白，HPLC-PDA檢測(cè)。舒巴坦?jié)舛仍?0～200μg/mL范圍內(nèi)，線性良好（R2=0.9998)，添加回收率為98.82%～101.42%，檢出限為0.25mg/kg，定量限為0.75mg/kg。該方法操作簡(jiǎn)單，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，適用于原料乳中舒巴坦的快速檢測(cè)。

舒巴坦，高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)法，含量測(cè)定，原料乳

舒巴坦（sulbactam，簡(jiǎn)稱SBT)，又稱青霉烷砜酸，屬于青霉烷砜類半合成β-內(nèi)酸胺酶抑制劑，是一種競(jìng)爭(zhēng)性、不可逆的β-內(nèi)酰胺酶抑制劑藥物[1]。臨床數(shù)據(jù)表明，過(guò)量使用舒巴坦可引起患者轉(zhuǎn)氨酶、堿性磷酸酶、乳酸脫氫酶升高，并可能引起皮疹，藥熱等過(guò)敏反應(yīng)。研究報(bào)道顯示，現(xiàn)有檢測(cè)舒巴坦的方法包括分光光度方法[2]、毛細(xì)管電泳方法[3]、氣-質(zhì)聯(lián)用方法[4]、液-質(zhì)聯(lián)用法[5]、高效液相方法[6-10]。分光光度方法的檢測(cè)限較低;毛細(xì)管電泳方法檢測(cè)基質(zhì)范圍有限;氣-質(zhì)聯(lián)用方法中，樣品前處理需要進(jìn)行衍生化反應(yīng)，操作復(fù)雜，回收率低;液-質(zhì)聯(lián)用法靈敏度高，抗干擾能力強(qiáng)，但是設(shè)備昂貴。高效液相法操作簡(jiǎn)便、成本低廉，便于推廣。自2009年春季起，一些違法份子在含有β-內(nèi)酰胺酶的原料乳中添加舒巴坦，使該酶失去活性，導(dǎo)致β-內(nèi)酰胺酶陽(yáng)性奶不能被檢測(cè)出來(lái)，為乳品安全埋下隱患，嚴(yán)重威脅消費(fèi)者的身體健康，降低了人民群眾對(duì)食品安全尤其是乳品安全的信任度，因此建立原料乳中舒巴坦的檢測(cè)方法已經(jīng)迫在眉睫，然而，國(guó)家尚未出臺(tái)舒巴坦的相關(guān)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。本研究工作建立了一種高效簡(jiǎn)便的檢測(cè)原料乳中舒巴坦的高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)方法，適用于檢測(cè)機(jī)構(gòu)、科研院所、工廠等單位進(jìn)行乳中舒巴坦的初步篩選。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

舒巴坦標(biāo)準(zhǔn)品 德國(guó)Dr.Ehrenstorfer GmbH，純度＞99%;乙腈 色譜純，Sigma公司;原料乳 黑龍江省哈爾濱市周邊奶站;磷酸、磷酸二氫鉀等其他試劑 國(guó)產(chǎn)分析純。

2695高效液相色譜儀、2998二極管陣列檢測(cè)器、Empower色譜工作站 美國(guó)Waters;BS210S型電子天平 北京賽多利斯天平有限公司;MILLIPORE超純水儀 美國(guó)密理博;色譜柱：Hypersil ODS C-18（250mm×4.6mm，5μm) Thenno Hypersil公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件 采用Hypersil ODS2 C-18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm);以5.44g/L磷酸二氫鉀溶液-乙腈（95∶5)為流動(dòng)相，緩沖液現(xiàn)用現(xiàn)配制，再經(jīng)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾。流速1mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm;柱溫30℃;進(jìn)樣體積10μL。

1.2.2 溶液制備

1.2.2.1 緩沖溶液 乙酸鋅溶液（200g/L)：稱取20g乙酸鋅于100mL容量瓶中，加水定容至刻度;磷酸溶液（1mol/L)：稱取6.28mL磷酸溶液于100mL容量瓶中，加水定容至刻度;磷酸鹽緩沖液（5.44g/L)：稱取5.4g磷酸二氫鉀，加入800mL水溶解，磷酸調(diào)pH至5.0，加水定容至1000mL。

1.2.2.2 儲(chǔ)備液 精密稱取100mg舒巴坦標(biāo)準(zhǔn)品，置于100mL容量瓶中，以磷酸鹽緩沖液溶解稀釋至刻度，搖勻，作為儲(chǔ)備液。標(biāo)準(zhǔn)工作液按實(shí)驗(yàn)需要用流動(dòng)相稀釋相應(yīng)濃度。

1.2.3 樣品處理 準(zhǔn)確稱取原料乳10g于三角瓶中，加入35mL乙腈，混勻，超聲提取30min。冷卻至室溫，加入200g/L乙酸鋅2.0mL，乙腈定容至50mL，渦旋0.5min，10000r/min離心5min，收集上清液10mL，10000r/min再離心5min，將上清液經(jīng)0.45μm濾膜過(guò)濾后，即可進(jìn)行HPLC-PDA測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品處理過(guò)程的確定

本實(shí)驗(yàn)采用有機(jī)沉淀體系（乙腈、甲醇)與無(wú)機(jī)沉淀體系相結(jié)合的方法沉淀樣品中的蛋白質(zhì)。由于原料乳中的蛋白質(zhì)含量較高，單純使用乙腈作為沉淀劑，無(wú)法沉淀完全，殘留的蛋白質(zhì)會(huì)堵塞色譜柱，影響實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行，因此采用乙腈初沉后，加入乙酸鋅再次沉淀原料乳中蛋白質(zhì)的兩段式沉淀法。當(dāng)采用甲醇作沉淀試劑時(shí)，在稀釋10倍下沉淀蛋白效果良好，但峰形較差，出現(xiàn)肩峰;最終采用乙腈作沉淀試劑，在稀釋5倍下沉淀蛋白效果良好，回收率理想，同時(shí)改善了峰形。

2.2 色譜條件的確定

參照美國(guó)藥典26版和日本藥典14版，檢測(cè)舒巴坦的波長(zhǎng)分別為230、220nm。本實(shí)驗(yàn)將舒巴坦標(biāo)準(zhǔn)溶液在190～400nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，見(jiàn)圖1。根據(jù)二極管陣列檢測(cè)器獲得的光譜圖可知，舒巴坦在194nm處有最大吸收，以此最大吸收波長(zhǎng)為檢測(cè)波長(zhǎng)，等濃度下對(duì)舒巴坦進(jìn)行HPLC測(cè)定，發(fā)現(xiàn)此時(shí)舒巴坦的峰值最高，峰面積穩(wěn)定。采用194nm檢測(cè)波長(zhǎng)，相同條件下對(duì)乳品中舒巴坦進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)雖然舒巴坦被定性保留，但由于乳基質(zhì)成分較多且復(fù)雜，前處理過(guò)程不可能把諸如短鈦物質(zhì)都沉淀完全，因此會(huì)有其他物質(zhì)的干擾，使舒巴坦峰的基線分離不完全，峰面積不準(zhǔn)確。基于以上原因，本實(shí)驗(yàn)最后選定末端吸收220nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖1 舒巴坦標(biāo)準(zhǔn)品全波長(zhǎng)掃描曲線Fig.1 The full scan curve of sulbactam standard solution

舒巴坦是極性物質(zhì)，易溶于水中，在甲醇中略溶[11]。因此本實(shí)驗(yàn)選用Hypersil ODS C-18（250mm× 4.6mm，5μm)色譜柱，舒巴坦得到較好的保留。參考2005版中國(guó)藥典[12]，確定流動(dòng)相為5.44g/L磷酸二氫鉀溶液-乙腈。舒巴坦易被強(qiáng)酸、強(qiáng)堿物質(zhì)降解[13]，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)緩沖鹽溶液pH＜3.0時(shí)，溶質(zhì)分子通常會(huì)降解成其他物質(zhì)，導(dǎo)致峰裂解;當(dāng)緩沖鹽溶液pH＞6.0時(shí)，舒巴坦幾乎全被降解成6-氨基青霉烷酸，導(dǎo)致主成分損失;當(dāng)緩沖鹽溶液pH4.0～5.0時(shí)，色譜峰窄而尖，舒巴坦性質(zhì)穩(wěn)定，沒(méi)有出現(xiàn)降解現(xiàn)象，因此，最終選擇pH5.0作為流動(dòng)相的酸堿度，舒巴坦保留良好，且達(dá)到基線分離。

從圖2中可以看出，舒巴坦標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間為5.027min，原料乳樣品中舒巴坦的保留時(shí)間為5.054min，與標(biāo)準(zhǔn)品中舒巴坦的保留時(shí)間基本一致。

圖2 舒巴坦標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖與原料乳中舒巴坦色譜圖Fig.2 Chromatograms of sulbactam standard solution and sulbactam in milk spiked

2.3 工作曲線

在上述色譜條件下，配制舒巴坦標(biāo)準(zhǔn)溶液10、50、100、150、200μg/mL每個(gè)濃度樣品平行3次實(shí)驗(yàn)。以峰面積（Y)為縱坐標(biāo)，濃度（X)為橫坐標(biāo)，得回歸方程y=10196x+70083，相關(guān)系數(shù)（R2)為0.9998，說(shuō)明在10～200μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，見(jiàn)圖3。該方法定量限為0.75mg/kg（按信噪比S/N＞10計(jì)算)，檢出限為0.25mg/kg（按信噪比S/N＞3計(jì)算)。

圖3 舒巴坦標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 The standard curve of sulbactam

2.4 精密度與回收率

采用標(biāo)準(zhǔn)添加法，取空白原料乳，分別加入舒巴坦標(biāo)準(zhǔn)溶液5、50、100μg/mL，進(jìn)行3個(gè)濃度水平的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，各濃度做3次平行，進(jìn)行HPLC-PAD測(cè)定，該方法的回收率在98.82%～101.42%、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.31%～2.76%之間，見(jiàn)表1。

表1 原料乳中添加舒巴坦的回收率和精密度Table 1 Recoveries and precisions of sulbactam in raw milk

3 結(jié)論

本研究采用反相C18色譜柱，以磷酸鹽緩沖溶液（pH5.0)-乙腈作為流動(dòng)相，樣品經(jīng)乙腈溶液提取，乙酸鋅沉淀蛋白，得到舒巴坦在原料乳中的保留時(shí)間為5.054min。該方法快速可靠，經(jīng)大量實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證，適合原料乳中舒巴坦的檢測(cè)要求，填補(bǔ)了國(guó)內(nèi)空白。建立了HPLC-PDA方法檢測(cè)乳中舒巴坦含量。采用二極管陣列檢測(cè)器對(duì)樣品峰進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，避免其他物質(zhì)的干擾，定性更可靠。樣品前處理操作簡(jiǎn)便、無(wú)需凈化，不但大大縮短了樣品前處理時(shí)間，同時(shí)也減少樣品在處理過(guò)程中的損失，使得分析物質(zhì)的回收率大大提高。因此采用HPLC-PDA法檢測(cè)原料乳中舒巴坦的含量具有更普遍的應(yīng)用性。

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Determination of sulbactam in raw milk by the high-performance liquid chromatography-photodiode array detection

LIU Shan-shan1，SHAN Yi2，MAN Chao-xin2，XIE Kun-hao1，LU Yan2，HU Hui-zhi1，YAN Tian-wen1，JIANG Yu-jun1，2，*
（1.Key Laboratory of Dairy Science，Ministry of Education，Department of Food Science，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China;2.National Research Center of Dairy Engineering and Technology，Northeast Agricultural University，Harbin 150086，China)

To develop a method for the determination of sulbactam in raw milk using high performance liquid chromatography-photodiode array detector（HPLC-PDA).C18column was used，the mobile phase consisted of 5.44g/L potassium dihydrogen phosphate solution（pH5.0)-acetonitrile（95∶5)at the flow rate of 1mL/min，the detection wavelength was 220nm.The column temperature was 30℃.Acetonitrile was used for extraction，zinc acetate was used for protein precipitation，the filtered fluid was determined by high performance liquid chromatography-photodiode array detector.The linear calibration curve was obtained in the concentration range of 1～200μg/mL（R2=0.9998)with the lower limit of detection of 0.25mg/kg and lower limit quantification of 0.75mg/kg.The average recovery of sulbactam was 98.82%～101.42%.The method was simple，accurate，reliable and could be used for rapid determination of sulbactam in raw milk.

sulbactam;high-performance liquid chromatography-photodiode array（HPLC-PDA)detection;content measured;raw milk

TS252.7

A

1002-0306（2012)16-0064-03

2012－01－06 *通訊聯(lián)系人

劉珊珊（1982-)，女，碩士研究生，研究方向：食品安全與質(zhì)量控制。

國(guó)家科技支撐計(jì)劃課題（2012BAK17B04);國(guó)家科技支撐計(jì)劃課題（2009BADB9B06)。