劉崇東 魯 琦 張震宇* 鄧海騰

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院婦產(chǎn)科，北京 100020;2.清華大學(xué)生命科學(xué)院，北京 100083)

先兆子癇是孕婦妊娠期特有的疾患，它的特點(diǎn)是孕20周后出現(xiàn)高血壓及妊娠蛋白尿。在發(fā)展中國家其發(fā)病率高達(dá)9.4% ～10.4%，是導(dǎo)致孕產(chǎn)婦和新生兒死亡的首要原因［1］。子癇和先兆子癇的診治水平與孕產(chǎn)婦病死率關(guān)系密切，而孕產(chǎn)婦病死率是評價(jià)國家衛(wèi)生保健事業(yè)水平的重要指標(biāo)。目前還沒有一種很好的實(shí)驗(yàn)指標(biāo)可以對先兆子癇進(jìn)行早期診斷。Roberts J M等［2］的研究表明，先兆子癇是一個多系統(tǒng)綜合征，有復(fù)雜的病理生理改變，例如:血管內(nèi)皮損傷、炎性反應(yīng)、凝血系統(tǒng)的激活和代謝的改變。目前普遍認(rèn)為先兆子癇的病理生理改變是由于一些蛋白的異常表達(dá)。這些蛋白的確認(rèn)對我們闡述先兆子癇的病理生理機(jī)制的分子基礎(chǔ)有很大幫助，也可以作為先兆子癇早期診斷的生物指標(biāo)。

使用蛋白質(zhì)組學(xué)方法對先兆子癇患者血清的研究蛋白質(zhì)進(jìn)行確認(rèn)，Gong L Y等［3］用SELDI-TOF-MS的方法研究，發(fā)現(xiàn)在妊娠高血壓疾病患者與正常妊娠婦女，血清中有10個異常蛋白表達(dá)峰。Blumenstein M等［4］應(yīng)用免疫沉淀技術(shù)和2D膠聯(lián)合，在先兆子癇患者中發(fā)現(xiàn)了39個差異表達(dá)蛋白，這些蛋白與脂代謝、凝血、血管重塑、蛋白酶抑制活性和炎性反應(yīng)有關(guān)。在本研究中，我們應(yīng)用親水親脂柱(hydrophiliclipophilic balance，HLB)和多肽配體庫磁珠(peptide ligand library bead，PLLB)的方法，去除血清中高表達(dá)蛋白使低含量蛋白表達(dá)豐富，對重度先兆子癇患者和正常妊娠婦女血清中的差異蛋白和一些炎性蛋白表達(dá)進(jìn)行分析。

1 材料和方法

1.1 樣本的收集

血清的樣本均來自于2008年1～12月首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院婦產(chǎn)科收治的孕晚期重度先兆子癇前期患者和正常孕足月產(chǎn)婦各5例，收集樣本。先兆子癇的診斷根據(jù)國際高血壓教育協(xié)作組對妊娠高血壓的診斷標(biāo)準(zhǔn)。妊娠20周以后出現(xiàn)臨床癥狀，伴有輕度頭暈、頭痛等;收縮壓≥160 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)，舒張壓≥110 mmHg，連續(xù) 2次血壓增高，每次至少間隔6 h;尿蛋白≥++，24 h蛋白尿≥5g/24 h;既往無高血壓及腎臟病史;既往無先兆子癇病史。取樣之前詳細(xì)向患者交代取樣方法、風(fēng)險(xiǎn)及樣本的用途?；颊叱浞种椴⒑炇鹬橥鈺?。知情同意書已被首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院倫理委員會審核通過。外周血獲得的樣本，靜放2 h，4 000 r/min 4℃快速離心10 min。然后儲存在－80℃冰箱等待分析使用。

1.2 樣本準(zhǔn)備

5份正常妊娠婦女的血清，5份重度先兆子癇患者血清分別混合在一起，等量血清120 mL，等量混合后共600 mL。600 mL血液分別用HLB和PLLB方法進(jìn)行樣本處理。

1.3 HLB血清處理

血清樣本分別稀釋到1 mL;1 mL純水+1 mL甲醇平衡HLB柱(均購自Thermo公司);2個分離柱分別加入正常孕婦血清和重度子癇孕婦血清，1%TFA(三氟乙酸，購自美國Abcam公司)清洗2遍;收集洗脫液。

1.4 PLLB血清處理

8 mg PLLB 磁珠 (Peptide International，Lexington，NY)放入100 μL 50% 甲醇10 min，pH7.4 PBS清洗3遍;2份血清和PLLB分別在室溫(22～25℃)搖擺器上培養(yǎng)2 h;去除未結(jié)合物質(zhì)，再次用pH7.4 PBS清洗3遍;與LDS 100℃ 共培養(yǎng)5 min，洗脫蛋白。

1.5 蛋白的分離、膠內(nèi)消化和LC/MS/MS分析

蛋白用4% ～12%Tris-Glycin梯度SDS膠 (Invitrogen，Grand Island，NY)進(jìn)行分離;用考馬斯亮藍(lán)進(jìn)行染色(Invitrogen，Grand Island，NY);每條帶切割15個小片段，切割后片段分別根據(jù)流程進(jìn)行膠內(nèi)消化。每份消化產(chǎn)物分別進(jìn)行LC-MS/MS分析。首先用Dionex 300 nano-HPLC系統(tǒng)進(jìn)行60 min的洗脫，流速為0.25 μL/min(購自 Thermo公司)，用 LTQ-Orbitrap質(zhì)譜使用Xcalibur 2.0.7軟件進(jìn)行操作，Orbitrap(400－1800 m/z，30，000 Resolution)單一氣相圖譜，連接6個數(shù)據(jù)獨(dú)立的MS/MS掃描。

1.6 數(shù)據(jù)處理和定量分析

每個從LC/MS/MS獲得的MS/MS圖譜都需從原始數(shù)據(jù)形式轉(zhuǎn)化為DTA文件(Bioworker 3.3.1，Thermo-Fisher，Sanlose，CA)使用Mascot針對人類IPI database搜索DTA文件;Mascot評分＞30，蛋白才被確認(rèn)，并且至少有2個獨(dú)立的肽段與之相匹配;應(yīng)用Perl script spectral counts對每個確認(rèn)的蛋白進(jìn)行定量分析;2組質(zhì)譜數(shù)比值大于2或小于0.5，認(rèn)定為有差異。

1.7 Western blotting分析

2例孕晚期重度先兆子癇患者60 μg蛋白和2例正常孕足月婦女60 μg血清蛋白分別用 NuPAGE Novx 40 12%Bis Tris梯度膠進(jìn)行分離 (Invitrogen，NY);轉(zhuǎn)膜30 min;4℃封閉過夜;室溫加入一抗孵育120 min;特異性抗體 RBP4和銅藍(lán)蛋白(ceruloplasmin，CP)(Abcam，Cambriage，MA);用 TBST(0.1%Tween 20，0.01 mol/L TBS)清洗;轉(zhuǎn)膜分別用與二抗(抗鼠)caruloplasmin進(jìn)行孵育，用ECL顯色劑曝光(Thermo，waltham，MA)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)使用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析處理，數(shù)值采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)的形式表示，采用單因素方差分析法分析入選孕婦年齡、孕周、血壓，以 P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 入選患者的一般情況

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院婦產(chǎn)科收治的孕晚期重度先兆子癇患者和正常孕足月產(chǎn)婦各5例。研究對象的基本情況見表1。

表1 研究對象特點(diǎn)Tab.1 Characteristic of the patients n=5

2.2 HLB處理血清樣本后SDS梯度膠結(jié)果

樣本條帶顯示清晰，15 000和10 000條帶可見明顯差異，但白蛋白區(qū)域條帶分離欠佳(圖1)。

圖1 HLB柱處理后的SDS-PAGE梯度膠Fig.1 SDS-PAGE treated by HLB

2.3 PLLB處理血清后SDS梯度膠結(jié)果

2組樣本顯示的條帶相似，表明處理后2組蛋白濃度無明顯改變。從PLLB洗脫后的蛋白，覆蓋蛋白的相對分子質(zhì)量從10 000～200 000，一些低含量蛋白也被豐富表達(dá)，但一些含量較高的蛋白水平明顯減低，例如:血清中的白蛋白(大約在67 000左右)，詳見圖2。

2.4 通過1D-LC/MS/MS對蛋白進(jìn)行鑒定

在重度先兆子癇患者中共采用HLB方法鑒定326種蛋白，采用PLLB鑒定方法1 172種蛋白;在正常妊娠婦女中共HLB方法鑒定342個蛋白，采用PLLB方法鑒定1 149個蛋白，詳見表2。

圖2 PLLB處理后SDS梯度膠Fig.2 A-SDS-PAGE gelimage treated by PLLB

表2 PLLB和HLB通過LC/MS/MS識別出的蛋白總數(shù)差異Tab.2 Total number of proteins identified by LC/MS/MS after depeletion of abundant proteins with PLLB beads and HLB cartridge

2.5 確定重度先兆子癇患者與正常妊娠對照中差異表達(dá)的蛋白

在HLB組19種蛋白上調(diào)，PLLB組30種蛋白上調(diào);HLB組9種蛋白下調(diào)表達(dá)，PLLB組21個蛋白下調(diào)表達(dá)(見表 3，4)。

表3 HLB和PLLB處理后蛋白上調(diào)及下調(diào)數(shù)量差異Tab.3 Up-regulated proteins and down-regulated proteins by HLB and PLLB

PLLB親和層析結(jié)合1D膠-LC/MS/MS識別出的在先兆子癇患者和正常妊娠婦女孕晚期中表達(dá)有差異的血清蛋白，詳見表4。

2.6 Western blotting分析

HLB和PLLB處理血清中，表達(dá)蛋白CP。見圖2結(jié)果顯示在重度先兆子癇中，CP上升。

表4 差異血清蛋白Tab.4 Differently expressed proteins

圖3 在重度先兆子癇中ceruleplasmin上升Fig.3 Elevated level of ceruleplasmin in serum of pregnant women with severe preeclampsia

3 討論

隨著人類基因圖譜的繪制成功，蛋白質(zhì)組學(xué)的出現(xiàn)，生物研究進(jìn)入了一種后基因組時(shí)代。生物學(xué)研究從對物質(zhì)活性研究為中心的時(shí)代轉(zhuǎn)化到以序列研究為基礎(chǔ)的時(shí)代。傳統(tǒng)的生物化學(xué)研究方法是先發(fā)現(xiàn)物質(zhì)的活性，然后進(jìn)行純化，然后再對其進(jìn)行確認(rèn)。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展，2D膠聚合質(zhì)譜技術(shù)對蛋白進(jìn)行捕獲已從最初的假說變成了現(xiàn)實(shí)。但2D膠因受膠大小的限制，使很多蛋白丟失。近幾年，1D膠聯(lián)合LC/MS/MS對血清、尿液、和腦脊液等中的蛋白進(jìn)行鑒定，取得了滿意的結(jié)果。

人類血清中85%表達(dá)豐富的6種蛋白(白蛋白，IgA和IgG，免疫球蛋白亞型，轉(zhuǎn)鐵蛋白，結(jié)合鐵蛋白)這些蛋白會覆蓋那些有意義但表達(dá)含量低的蛋白。故質(zhì)譜檢測前需要對樣本進(jìn)行處理，去除表達(dá)豐富的蛋白。使一些表達(dá)含量低，但在發(fā)病中起重要作用的蛋白充分表達(dá)，使之容易檢測和測定。

本研究應(yīng)用PLLB聯(lián)合1D-LC/MS/MS分析重度先兆子癇患者和正常妊娠婦女血清中差異蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)PLLB是減少血清中高表達(dá)蛋白使低表達(dá)蛋白表達(dá)豐富的有效辦法，并且有較高的重復(fù)性。用1D膠分析PLLB處理后的血清樣本，在本研究中和文獻(xiàn)中均獲得滿意圖像。與其他親和洗脫方法相同，PLLB可以使亞蛋白質(zhì)組表達(dá)豐富，主要通過多肽六聚體選擇性與蛋白相結(jié)合。不能與多肽六聚體結(jié)合的蛋白不能保留在磁珠上。用PLLB處理血清，重度先兆子癇患者和正常妊娠婦女相比，有51種蛋白出現(xiàn)差異表達(dá)。

在差異表達(dá)蛋白中，有多種蛋白與急性炎性反應(yīng)有關(guān)，如 ApoA2，ApoH，SAA4，CP，TRIMS，IL-17F等。在重度先兆子癇婦女血清中CP和IL-17F明顯上調(diào)。

Sacks G P等［8］通過流式細(xì)胞學(xué)研究認(rèn)為，正常妊娠過程中的炎性反應(yīng)是通過血清中IL-6和TNF-a濃度升高，激活中性粒細(xì)胞中的單核細(xì)胞，Cosmi L等［9］研究表明，IL-17F 來源于 CD161+，CD4+自然殺傷細(xì)胞，IL-17F作為多效性細(xì)胞因子作用在免疫和非免疫細(xì)胞上，在很多細(xì)胞上都有IL-17的受體，例如成骨細(xì)胞、纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等［10］。IL-17配體在體外可誘導(dǎo)IL-6和IL-8的產(chǎn)生，刺激T細(xì)胞增生和很多前炎性分子的上調(diào);進(jìn)而產(chǎn)生一系列免疫反應(yīng)，在宿主免疫防御中起到重要作用［11-12］。Borekci B等［13］研究認(rèn)為先兆子癇孕婦與正常妊娠孕婦相比，血清TNF-a和IL-6濃度升高，尤其在重度先兆子癇孕婦中升高更加明顯［14］。IL-6升高只通過先升高IL-17F，然后使IL-6升高，尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。循環(huán)中CP含有1 046氨基酸蛋白，查對分子質(zhì)量大約在133 000［15］，是一種急性期反應(yīng)蛋白，在感染、組織損傷、炎性細(xì)胞因子介導(dǎo)中血清明顯增高［16］。在本研究中，通過HLB和PLLB方法證明CP在重度子癇孕婦中明顯增高，并且通過Western blotting驗(yàn)證，與既往研究結(jié)果相似。

先兆子癇是一種影響多器官的疾病，目前病因尚不清楚，氧化應(yīng)激和炎性因子的作用引起血管內(nèi)皮的損傷，導(dǎo)致先兆子癇及相應(yīng)心血管疾病的發(fā)生，可能是一種主要的發(fā)病機(jī)制。前炎性細(xì)胞因子的主要生物活性，包括炎性反應(yīng)和對內(nèi)皮細(xì)胞活性的影響，先兆子癇患者血清中炎性因子的增加，可能是引起疾病癥狀的原因，也可能是疾病發(fā)生后產(chǎn)生的結(jié)果。

總之，本研究結(jié)果表明，PLLB結(jié)合1D-LC/MS/MS分析重度先兆子癇患者與正常妊娠婦女血清中差異表達(dá)蛋白是一種有效地方法，一些急性反應(yīng)因子可能與先兆子癇的發(fā)病機(jī)制相關(guān)。

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