宋菁華 王克芳 李 斌 張 軍

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院婦產(chǎn)科，北京100029)

宮頸癌是發(fā)生于全球婦女中僅次于乳腺癌的最常見(jiàn)的惡性腫瘤，全世界每年大約有50萬(wàn)例新發(fā)宮頸癌病例，每年近30萬(wàn)死亡病例，中晚期患者5年生存率很低［1］。目前宮頸癌病因尚未完全明了，在基礎(chǔ)研究領(lǐng)域，宮頸癌發(fā)病的分子機(jī)制始終是研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。近年來(lái)，隨著腫瘤干細(xì)胞學(xué)說(shuō)［2］的提出，以及越來(lái)越多的腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells，CSC;或tumour stem cells，TSC)相繼在腫瘤組織中分離成功，為腫瘤研究提供了新的途徑。側(cè)群細(xì)胞(side population cells)即SP細(xì)胞是指一小群可以將脂溶性DNA結(jié)合染料(即Hoechst 33342)排出細(xì)胞外的細(xì)胞，在流式分選的散點(diǎn)圖中，這些細(xì)胞處于大多數(shù)細(xì)胞的一側(cè)。研究［3］顯示，SP細(xì)胞具有干細(xì)胞特性。盡管目前各學(xué)科對(duì)腫瘤干細(xì)胞的研究進(jìn)行得如火如荼，但在宮頸癌中，無(wú)論是針對(duì)宮頸癌干細(xì)胞的研究還是針對(duì)宮頸癌側(cè)群細(xì)胞的研究，都處在起步階段。本課題立足于腫瘤干細(xì)胞學(xué)說(shuō)，擬通過(guò)宮頸癌細(xì)胞中側(cè)群細(xì)胞的富集、分離和鑒定，確定其腫瘤干細(xì)胞特性，探討以側(cè)群細(xì)胞作為宮頸癌干細(xì)胞研究切入點(diǎn)的可行性，為進(jìn)一步研究宮頸癌干細(xì)胞的靶向治療策略奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1)標(biāo)本來(lái)源:選取2009年12月至2010年12月于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院婦產(chǎn)科施行宮頸癌手術(shù)的病例標(biāo)本40例(均經(jīng)患者或委托人知情同意)，其中鱗癌32例、腺癌6例、惡性腺瘤1例、腺鱗癌1例。40例標(biāo)本中高分化癌5例、中分化癌23例、低分化癌12例。腫瘤均為原發(fā)性，術(shù)前均未進(jìn)行放療和化療，所有標(biāo)本均經(jīng)北京安貞醫(yī)院病理科2名以上有經(jīng)驗(yàn)的病理科醫(yī)師確診為宮頸癌并按國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(Federation International of Gynecology and Obstetrics，F(xiàn)IGO)2009年宮頸癌的臨床分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期。所有標(biāo)本均在手術(shù)切除后30min內(nèi)取材并送實(shí)驗(yàn)室。

2)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:雌性非肥胖型糖尿病/重癥聯(lián)合免疫缺陷(non-obese diabetic/severe combined immunodeficiency，NOD/SCID)小鼠，4～6周齡，購(gòu)買并飼養(yǎng)在北京大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(京)2006－0008］。

3)實(shí)驗(yàn)試劑:DMEM/F12 1:1培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone公司，胎牛血清(FBS)購(gòu)自Gibco公司，0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液、青鏈霉素混合液購(gòu)自Solarbio公司，碘化丙咤(Pl)、維拉帕米(verapamil hydrochloride)、Hoechst 33342、二甲基亞砜(DMSO)、四甲基噻唑藍(lán)(MTT)和膠原酶I購(gòu)自Sigma-Aldrich公司，磷酸鹽緩沖液(PBS)購(gòu)自貝博生物公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1)宮頸癌細(xì)胞原代培養(yǎng)及細(xì)胞傳代:術(shù)中在新鮮腫瘤組織邊緣無(wú)壞死、鈣化及電凝部位無(wú)菌取材，置于培養(yǎng)基中(DMEM/F12，內(nèi)含10%FBS)。修剪去除壞死組織及殘余血管，用PBS沖洗3遍，將組織塊剪碎，經(jīng)0.14%Ⅰ型膠原酶和0.25%胰蛋白酶-EDTA 37℃分別消化30min，100μm濾網(wǎng)過(guò)濾去渣，4℃下1 000 r/min離心10min，棄上清，收集含細(xì)胞的沉淀，移至培養(yǎng)瓶中，以含有10%FBS、100U/mL青霉素、100mg/mL鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基在37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，洗掉未貼壁細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)。從取材到接種在2h內(nèi)完成。原代培養(yǎng)3～5d時(shí)行第1次換液，以后每3～4 d半量換液1次，每7d按1∶2傳代。

2)流式分選:選取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶-EDTA消化，將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×106/mL。向?qū)嶒?yàn)組及對(duì)照組細(xì)胞懸液中加入Hoechst 33342至終濃度為5μg/mL，對(duì)照組在加入 Hoechst 33342前加拮抗劑維拉帕米至終濃度50μg/mL，避光，于 37℃孵育90min，每隔 15min混勻 1次。4℃1 000 r/min離心10 min，去上清，預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞1遍。以含2%FBS的PBS重懸，經(jīng)40μm濾網(wǎng)過(guò)濾后于4℃下存放至檢測(cè)。碘化丙啶(PI)染色標(biāo)記死亡細(xì)胞，過(guò)流式細(xì)胞儀前5min加入PI至終濃度1μg/mL，。將制備好的細(xì)胞懸液入流式細(xì)胞儀，檢測(cè)SP細(xì)胞的比例。參數(shù)如下:激發(fā)波:HOE:UV(351-364)HOE blue:450 HOE red:675 Pl:488nm。為了剔除因維拉帕米未能完全拮抗帶來(lái)的可能誤差，SP細(xì)胞的比例取實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間的差值。在相同波長(zhǎng)條件下，對(duì)已通過(guò)檢測(cè)的細(xì)胞懸液進(jìn)行分選，得到宮頸癌側(cè)群(SP)細(xì)胞和非側(cè)群(NSP)細(xì)胞亞群。

3)宮頸癌SP和NSP細(xì)胞生物學(xué)功能鑒定

①細(xì)胞生長(zhǎng)曲線:將新鮮分離的SP和NSP細(xì)胞分別接種于96孔板，1 000個(gè)細(xì)胞/孔，分別接種32孔，每孔加入200 μL完全培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng);24h后，SP和NSP細(xì)胞各取4孔，分別加入50mg/mL的MTT 20 μL，置37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱4h;取出培養(yǎng)板，吸凈培養(yǎng)液及MTT，每孔加入 DMSO 150 μL，搖床震蕩 10min，酶標(biāo)儀讀OD490值;每24 h測(cè)1次OD490值，每次SP和NSP各4孔，連續(xù)測(cè)8 d，4孔OD490的平均值即為當(dāng)天細(xì)胞的OD值;實(shí)驗(yàn)共重復(fù)3次。取3次實(shí)驗(yàn)的平均數(shù)繪制生長(zhǎng)曲線。

②裸鼠移植瘤試驗(yàn):選取4～6周齡NOD/SCID雌性裸鼠32只，采用抽簽法隨機(jī)分為8組，每組4只。按照三級(jí)動(dòng)物要求，飼養(yǎng)在25℃恒溫?zé)o特定病原體(specific pathogen free，SPF)屏障系統(tǒng)內(nèi)，12 h光照和12 h黑暗交替，自由進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料及飲水。將新鮮分離的SP和NSP細(xì)胞離心，PBS重懸，計(jì)數(shù)，以PBS調(diào)整細(xì)胞密度為 1×103、1×104、1 ×105、1×106/mL，將不同密度SP和NSP細(xì)胞各0.1 mL接種于裸鼠右側(cè)背部皮下，每種細(xì)胞每個(gè)數(shù)量級(jí)接種4只裸鼠，觀察8周。

③化療藥物敏感性分析:化療藥物選擇順鉑。將新鮮分離的SP和NSP細(xì)胞接種至96孔板，1 000個(gè)細(xì)胞/孔，加入200 μL完全培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng);吸凈培養(yǎng)基，分別加入不同終濃度的順鉑(0、12.5、25、50、100、200μg/mL)，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，其中0濃度為無(wú)藥對(duì)照，另設(shè)3孔只加培養(yǎng)液不加細(xì)胞作為調(diào)零孔。每孔培養(yǎng)基調(diào)整為200μL，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h;從培養(yǎng)箱中取出96孔板，每孔加入已配置好的MTT 20 μL，37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h;棄去上清，每孔加入DMSO 150 μL，于振蕩器上振蕩10 min，使其徹底溶解混勻;酶標(biāo)儀讀OD490值，以只加培養(yǎng)液不加細(xì)胞的孔作為調(diào)零孔進(jìn)行調(diào)零，取3個(gè)復(fù)孔的均值為實(shí)驗(yàn)結(jié)果。計(jì)算細(xì)胞增生抑制率:細(xì)胞增生抑制率=1－實(shí)驗(yàn)組OD值/無(wú)藥對(duì)照組OD值;實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取3次抑制率的平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)分析用SPSS 11.5軟件完成，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s)表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理分別采用t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)、方差分析。以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人宮頸癌細(xì)胞形態(tài)

光學(xué)顯微鏡下，宮頸癌細(xì)胞形態(tài)符合病理學(xué)描述(圖1)，符合本研究需要。

圖1 人宮頸癌細(xì)胞Fig.1 Human cervical cancer cells(100×)

2.2 宮頸癌SP細(xì)胞流式檢測(cè)結(jié)果

人宮頸癌細(xì)胞染色后去除PI陽(yáng)性的死細(xì)胞，分析狀態(tài)良好的活細(xì)胞Hoechst 33342熒光染色情況。流式細(xì)胞儀可檢測(cè)到宮頸癌細(xì)胞中SP細(xì)胞的存在比例約為0.90% ～3.40%(2.04% ±0.93%)，加入維拉帕米的對(duì)照管SP細(xì)胞比例下降至0%或接近0%的水平(圖2)。不同分化程度的宮頸癌細(xì)胞分別檢測(cè)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，即在檢測(cè)的高、中、低分化的宮頸癌細(xì)胞中，SP細(xì)胞比例與分化程度有關(guān)，分化程度越差者其SP細(xì)胞比例越低，詳見(jiàn)表1。

表1 不同分化程度宮頸癌細(xì)胞SP比例Tab.1 Proportion of the SP cells with different degree of cervical cancer cells

2.3 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

MTT法繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，結(jié)果顯示:SP細(xì)胞與NSP細(xì)胞相比生長(zhǎng)速度較快，從第3天開始，SP細(xì)胞開始大量增生，尤其是第5天起，SP細(xì)胞明顯進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)期，而NSP細(xì)胞增生緩慢(圖3)。SP細(xì)胞和NSP細(xì)胞的增生能力差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.4 裸鼠成瘤效果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SP細(xì)胞和NSP細(xì)胞的致瘤能力差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)，僅1×103個(gè)SP細(xì)胞即可形成腫瘤，平均成瘤時(shí)間(13.27±2.61)d。而至少1×105個(gè)NSP細(xì)胞才能形成腫瘤，平均成瘤時(shí)間(18.50±1.52)d。相同數(shù)量的SP細(xì)胞在同一觀察時(shí)間點(diǎn)可以形成更大的腫瘤，且形成腫瘤的潛伏期較短。

圖2 人宮頸癌SP細(xì)胞流式檢測(cè)圖Fig.2 Expressions of cell related markers in human cervical cancer cells as detected by flow cytometry A:Hoechst 33342;B:Hoechst 33342 and verapamil;SP:side population.

圖3 宮頸癌SP和NSP細(xì)胞生長(zhǎng)曲線Fig.3 Cell growth curve of SP cells and NSP cells

2.5 化療藥物敏感性分析

將SP細(xì)胞和NSP細(xì)胞分別在不同濃度的化療藥物中作用24h后，應(yīng)用MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活狀況。結(jié)果顯示:化療藥物作用后，SP和NSP細(xì)胞均出現(xiàn)一定程度的細(xì)胞死亡，但SP細(xì)胞表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐藥性，只出現(xiàn)少量細(xì)胞死亡，而NSP細(xì)胞存活明顯減少，細(xì)胞增生抑制率顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)表3。

表2 宮頸癌SP和NSP細(xì)胞裸鼠的成瘤性情況Tab.2 Tumorigenicity of SP cells and NSP cells in nude mice

表3 宮頸癌SP和NSP細(xì)胞增生抑制率情況Tab.3 Inhibition rates of SP cells and NSP cells n=9，%

3 討論

腫瘤干細(xì)胞是存在于腫瘤中的一小部分具有干細(xì)胞性質(zhì)的細(xì)胞群，具有自我更新能力，能夠分化成不同表型的腫瘤細(xì)胞，使腫瘤在體內(nèi)不斷擴(kuò)大或形成新的腫瘤。除此之外的其他絕大多數(shù)腫瘤細(xì)胞沒(méi)有或僅有有限的增生能力，經(jīng)短暫的分化增生后即發(fā)生凋亡。腫瘤干細(xì)胞的分離和鑒定最初來(lái)源于血液系統(tǒng)惡性腫瘤，而實(shí)體腫瘤細(xì)胞較難以分離。目前腫瘤干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)主要有2種方法，即通過(guò)細(xì)胞表面特異性標(biāo)記進(jìn)行分選和側(cè)群(SP)細(xì)胞分選法。組織特異性干細(xì)胞的嚴(yán)格分離鑒定只在少數(shù)組織中完成，許多實(shí)體組織自身的干細(xì)胞表面標(biāo)志物尚未確定，故限制了此方法的應(yīng)用。SP細(xì)胞作為一個(gè)特殊的細(xì)胞亞群，其發(fā)育和分化狀態(tài)可能介于胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞之間，具有很強(qiáng)的多向分化潛能和增生特性，且有較明確的表型標(biāo)記和分離純化方法，以SP細(xì)胞作為切入點(diǎn)來(lái)進(jìn)行宮頸癌干細(xì)胞篩選，可望為進(jìn)一步深入研究宮頸癌干細(xì)胞建立基礎(chǔ)。

本研究選用宮頸癌原代培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行流式分選，為了剔除因維拉帕米未能完全拮抗帶來(lái)的可能誤差，SP細(xì)胞的比例取實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間的差值。結(jié)果顯示，宮頸癌細(xì)胞中存在一定數(shù)量的SP細(xì)胞，比例約為0.90% ～3.40%(2.04% ±0.93%)，并可被維拉帕米阻斷，阻斷后 SP細(xì)胞比例減少至0～0.60%(0.28%±0.20%)。SP細(xì)胞的比例隨分化程度的降低而下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。迄今，有關(guān)腫瘤分化程度與SP細(xì)胞比例的關(guān)系報(bào)道較少，且意見(jiàn)不一。Brown M D等［4］研究前列腺腫瘤時(shí)發(fā)現(xiàn)，腫瘤分化程度越高，其SP細(xì)胞比例越高。而Wu C等［5］發(fā)現(xiàn)分化不良的間葉源性腫瘤中的SP細(xì)胞比例高于分化良好的腫瘤細(xì)胞。目前對(duì)這一現(xiàn)象仍缺乏公認(rèn)的解釋，推測(cè)出現(xiàn)上述差異的原因可能有:①分化較差的宮頸癌細(xì)胞中SP細(xì)胞的增生能力和自我更新能力可能更強(qiáng)，故只需較低比例的SP細(xì)胞即可維持腫瘤的惡性生物學(xué)行為;②分化較差的宮頸癌細(xì)胞中NSP細(xì)胞的增生能力可能更強(qiáng)，在SP細(xì)胞絕對(duì)數(shù)相似的情況下，NSP細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)較大，從而導(dǎo)致其SP細(xì)胞的相對(duì)比例下降。

作為一個(gè)特殊的細(xì)胞亞群，SP細(xì)胞具備自我更新能力和高致瘤性。Xu J X等［6］研究發(fā)現(xiàn)SP細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)可以達(dá)到1 000～5 000倍，而NSP細(xì)胞的擴(kuò)增有時(shí)甚至不能達(dá)到2倍。為了探討分選出的SP細(xì)胞是否具有腫瘤干細(xì)胞特性，我們進(jìn)行了一系列的實(shí)驗(yàn)。采用MTT法檢測(cè)SP細(xì)胞和NSP細(xì)胞的增生能力，發(fā)現(xiàn)SP細(xì)胞的增生能力顯著強(qiáng)于NSP細(xì)胞，2組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與宮頸癌NSP細(xì)胞相比，宮頸癌SP細(xì)胞具有更強(qiáng)的增生能力。在腦膠質(zhì)瘤［7］、神經(jīng)母細(xì)胞瘤［8］、鼻咽癌［9］、乳腺癌［10］、肝癌［11］等多種腫瘤的研究中均有類似發(fā)現(xiàn)。但也有學(xué)者對(duì)這一現(xiàn)象提出質(zhì)疑，認(rèn)為NSP細(xì)胞在分選后增生較差，可能與分選采用的Hoechst 33342對(duì)NSP細(xì)胞的毒性作用有關(guān)［12］，然而，Hoechst 33342 染料的半衰期較短，且在分裂過(guò)程中難以大量傳入子代細(xì)胞中而影響其增生［13］，單純以Hoechst 33342染料的毒性作用來(lái)解釋上述現(xiàn)象難以令人信服。為了探求宮頸癌SP細(xì)胞的致瘤能力，我們采用NOD/SCID小鼠行皮下接種成瘤實(shí)驗(yàn)，把不同數(shù)量級(jí)的SP和NSP細(xì)胞移植到NOD/SCID小鼠皮下，發(fā)現(xiàn)SP細(xì)胞的成瘤能力明顯強(qiáng)于NSP細(xì)胞。

大量臨床和基礎(chǔ)研究［2，7-8］顯示，各種腫瘤對(duì)化療藥物的敏感性不一，許多腫瘤經(jīng)過(guò)手術(shù)和藥物治療，腫瘤已經(jīng)幾乎消失，但是，很快又復(fù)發(fā)了。根據(jù)干細(xì)胞學(xué)說(shuō)［14］，干細(xì)胞一般對(duì)化療藥物耐藥，能夠排除化療藥物的毒性，從而成功逃避化療藥物的作用，從而存活下來(lái)。雖然大部分腫瘤細(xì)胞被殺死了，但是只要腫瘤干細(xì)胞還存在，腫瘤就會(huì)很容易復(fù)發(fā)。因此探討腫瘤細(xì)胞的耐藥性，尋找腫瘤復(fù)發(fā)的原因，為腫瘤化療提供新的靶點(diǎn)，具有重要的臨床意義。由于在部分組織中SP細(xì)胞表型產(chǎn)生的主要因素是ABCG2/BCRP1的表達(dá)，而ABCG2/BCRP1又是主要的耐藥蛋白［15］，故我們推測(cè)，SP細(xì)胞可能和宮頸癌的化療耐藥相關(guān)。我們用MTT法檢測(cè)化療藥物順鉑對(duì)SP和NSP細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，發(fā)現(xiàn)順鉑對(duì)NSP細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制明顯，對(duì)SP細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制不明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。這個(gè)結(jié)果支持SP細(xì)胞可能和宮頸癌化療耐藥相關(guān)的假設(shè)。

本研究應(yīng)用流式細(xì)胞儀分選宮頸癌SP細(xì)胞，經(jīng)各種體內(nèi)、外鑒定實(shí)驗(yàn)證實(shí)，宮頸癌SP細(xì)胞具有腫瘤干細(xì)胞的生物學(xué)特性，生長(zhǎng)速度快，自我更新和分化能力強(qiáng)，且具有強(qiáng)大的致瘤性和耐藥性，可作為宮頸癌干細(xì)胞研究的切入點(diǎn)，為宮頸癌干細(xì)胞的靶向治療深入研究提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

［1］豐有吉，沈鏗.婦產(chǎn)科學(xué)［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2010:316-322.

［2］Reya T，Morrison S J，Clarke M F，et al.Stem cells，cancer，and cancer stem cells［J］.Nature，2001，414(6859):105-111.

［3］Fong D，Yeh A，Naftalovich R，et al.Curcumin inhibits the side population(SP)phenotype of the rat C6 glioma cell line:towards targeting of cancer stem cells with phytochemicals［J］.Cancer Lett，2010，293(1):65-72.

［4］Brown M D，Gilmore P E，Hart C A，et al.Characterization of benign and malignant prostate epithelial Hoechst 33342 side population［J］.Prostate，2007，67(13):1384-1396.

［5］Wu C，Wei Q，Utomo V，et al.Side population cells isola-ted from mesenchymal neoplasms have tumor initiating potential［J］.Cancer Res，2007，67(17):8216-8222.

［6］Xu J X，Morii E，Liu Y，et al.High tolerance to apoptotic stimuli induced by serum depletion and ceramide in sidepopulation cells:high expression of CD55 as a novel character for side-population［J］.Exp Cell Res，2007，313(9):1877-1885.

［7］Kondo T，Setoguchi T，Taga T，et al.Persistence of a small subpopulation of cancer stem-like cells in the C6 glioma cell line［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2004，101(3):781-786.

［8］Hirschmann-Jax C，F(xiàn)oster A E，Wufl G G，et al.A distinact“side population”of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2004，101(39):14228-14333.

［9］Wang J，Guo L P，Chen L Z，et al.Identifieation of Caneer stem cell-like side population cells in human nasopharyngeal carcinoma cell line［J］.Semin Cancer Res，2007，67(8):3716-3724.

［10］Christgen M，Ballmarier M，Bruchhardt H，et al.Identification of a distinct side population of cancer cells in the Cal-51 human breast carcinoma cell line［J］.Mol Cell Bioehem，2007，306(1):201-212.

［11］張毅，竇科峰，宋文杰，等.MHCC97中邊緣群細(xì)胞的成瘤性及其侵襲性觀察［J］.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，29(3):252-254.

［12］Zheng X，Shen G，Yang X，et al.Most C6 cells are cancer stem cells:evidence from clonal and population analyses［J］.Cancer Res，2007，67(8):3691-3697.

［13］Reders R P，Li A，Kaur P.Side population in adult murine epidermis exhibits phenotypic and functional characteristics of keratinocyte stem cells［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2006，103(35):13168-13173.

［14］Shackleton M.Normal stem cells and cancer stem cells:similar and different［J］.Semin Cancer Biol，2010，20(2):85-92.

［15］Zhou S，Morris J J，Barnes Y，et al.Bcrp1 gene expression is required for normal numbers of side population stem cells in mice，and confers relative protection to mitoxantrone in hematopoietic cells in vivo［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2002，99(19):12339-12344.