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        人宮頸癌側(cè)群細(xì)胞的分選及其生物學(xué)特性的研究

        2012-10-25 05:21:40宋菁華王克芳
        關(guān)鍵詞:培養(yǎng)箱干細(xì)胞分化

        宋菁華 王克芳 李 斌 張 軍

        (首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院婦產(chǎn)科,北京100029)

        宮頸癌是發(fā)生于全球婦女中僅次于乳腺癌的最常見(jiàn)的惡性腫瘤,全世界每年大約有50萬(wàn)例新發(fā)宮頸癌病例,每年近30萬(wàn)死亡病例,中晚期患者5年生存率很低[1]。目前宮頸癌病因尚未完全明了,在基礎(chǔ)研究領(lǐng)域,宮頸癌發(fā)病的分子機(jī)制始終是研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。近年來(lái),隨著腫瘤干細(xì)胞學(xué)說(shuō)[2]的提出,以及越來(lái)越多的腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells,CSC;或tumour stem cells,TSC)相繼在腫瘤組織中分離成功,為腫瘤研究提供了新的途徑。側(cè)群細(xì)胞(side population cells)即SP細(xì)胞是指一小群可以將脂溶性DNA結(jié)合染料(即Hoechst 33342)排出細(xì)胞外的細(xì)胞,在流式分選的散點(diǎn)圖中,這些細(xì)胞處于大多數(shù)細(xì)胞的一側(cè)。研究[3]顯示,SP細(xì)胞具有干細(xì)胞特性。盡管目前各學(xué)科對(duì)腫瘤干細(xì)胞的研究進(jìn)行得如火如荼,但在宮頸癌中,無(wú)論是針對(duì)宮頸癌干細(xì)胞的研究還是針對(duì)宮頸癌側(cè)群細(xì)胞的研究,都處在起步階段。本課題立足于腫瘤干細(xì)胞學(xué)說(shuō),擬通過(guò)宮頸癌細(xì)胞中側(cè)群細(xì)胞的富集、分離和鑒定,確定其腫瘤干細(xì)胞特性,探討以側(cè)群細(xì)胞作為宮頸癌干細(xì)胞研究切入點(diǎn)的可行性,為進(jìn)一步研究宮頸癌干細(xì)胞的靶向治療策略奠定基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 實(shí)驗(yàn)材料

        1)標(biāo)本來(lái)源:選取2009年12月至2010年12月于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院婦產(chǎn)科施行宮頸癌手術(shù)的病例標(biāo)本40例(均經(jīng)患者或委托人知情同意),其中鱗癌32例、腺癌6例、惡性腺瘤1例、腺鱗癌1例。40例標(biāo)本中高分化癌5例、中分化癌23例、低分化癌12例。腫瘤均為原發(fā)性,術(shù)前均未進(jìn)行放療和化療,所有標(biāo)本均經(jīng)北京安貞醫(yī)院病理科2名以上有經(jīng)驗(yàn)的病理科醫(yī)師確診為宮頸癌并按國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(Federation International of Gynecology and Obstetrics,F(xiàn)IGO)2009年宮頸癌的臨床分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期。所有標(biāo)本均在手術(shù)切除后30min內(nèi)取材并送實(shí)驗(yàn)室。

        2)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:雌性非肥胖型糖尿病/重癥聯(lián)合免疫缺陷(non-obese diabetic/severe combined immunodeficiency,NOD/SCID)小鼠,4~6周齡,購(gòu)買并飼養(yǎng)在北京大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(京)2006-0008]。

        3)實(shí)驗(yàn)試劑:DMEM/F12 1:1培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone公司,胎牛血清(FBS)購(gòu)自Gibco公司,0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液、青鏈霉素混合液購(gòu)自Solarbio公司,碘化丙咤(Pl)、維拉帕米(verapamil hydrochloride)、Hoechst 33342、二甲基亞砜(DMSO)、四甲基噻唑藍(lán)(MTT)和膠原酶I購(gòu)自Sigma-Aldrich公司,磷酸鹽緩沖液(PBS)購(gòu)自貝博生物公司。

        1.2 實(shí)驗(yàn)方法

        1)宮頸癌細(xì)胞原代培養(yǎng)及細(xì)胞傳代:術(shù)中在新鮮腫瘤組織邊緣無(wú)壞死、鈣化及電凝部位無(wú)菌取材,置于培養(yǎng)基中(DMEM/F12,內(nèi)含10%FBS)。修剪去除壞死組織及殘余血管,用PBS沖洗3遍,將組織塊剪碎,經(jīng)0.14%Ⅰ型膠原酶和0.25%胰蛋白酶-EDTA 37℃分別消化30min,100μm濾網(wǎng)過(guò)濾去渣,4℃下1 000 r/min離心10min,棄上清,收集含細(xì)胞的沉淀,移至培養(yǎng)瓶中,以含有10%FBS、100U/mL青霉素、100mg/mL鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基在37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h,洗掉未貼壁細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)。從取材到接種在2h內(nèi)完成。原代培養(yǎng)3~5d時(shí)行第1次換液,以后每3~4 d半量換液1次,每7d按1∶2傳代。

        2)流式分選:選取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,0.25%胰蛋白酶-EDTA消化,將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×106/mL。向?qū)嶒?yàn)組及對(duì)照組細(xì)胞懸液中加入Hoechst 33342至終濃度為5μg/mL,對(duì)照組在加入 Hoechst 33342前加拮抗劑維拉帕米至終濃度50μg/mL,避光,于 37℃孵育90min,每隔 15min混勻 1次。4℃1 000 r/min離心10 min,去上清,預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞1遍。以含2%FBS的PBS重懸,經(jīng)40μm濾網(wǎng)過(guò)濾后于4℃下存放至檢測(cè)。碘化丙啶(PI)染色標(biāo)記死亡細(xì)胞,過(guò)流式細(xì)胞儀前5min加入PI至終濃度1μg/mL,。將制備好的細(xì)胞懸液入流式細(xì)胞儀,檢測(cè)SP細(xì)胞的比例。參數(shù)如下:激發(fā)波:HOE:UV(351-364)HOE blue:450 HOE red:675 Pl:488nm。為了剔除因維拉帕米未能完全拮抗帶來(lái)的可能誤差,SP細(xì)胞的比例取實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間的差值。在相同波長(zhǎng)條件下,對(duì)已通過(guò)檢測(cè)的細(xì)胞懸液進(jìn)行分選,得到宮頸癌側(cè)群(SP)細(xì)胞和非側(cè)群(NSP)細(xì)胞亞群。

        3)宮頸癌SP和NSP細(xì)胞生物學(xué)功能鑒定

        ①細(xì)胞生長(zhǎng)曲線:將新鮮分離的SP和NSP細(xì)胞分別接種于96孔板,1 000個(gè)細(xì)胞/孔,分別接種32孔,每孔加入200 μL完全培養(yǎng)基,置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng);24h后,SP和NSP細(xì)胞各取4孔,分別加入50mg/mL的MTT 20 μL,置37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱4h;取出培養(yǎng)板,吸凈培養(yǎng)液及MTT,每孔加入 DMSO 150 μL,搖床震蕩 10min,酶標(biāo)儀讀OD490值;每24 h測(cè)1次OD490值,每次SP和NSP各4孔,連續(xù)測(cè)8 d,4孔OD490的平均值即為當(dāng)天細(xì)胞的OD值;實(shí)驗(yàn)共重復(fù)3次。取3次實(shí)驗(yàn)的平均數(shù)繪制生長(zhǎng)曲線。

        ②裸鼠移植瘤試驗(yàn):選取4~6周齡NOD/SCID雌性裸鼠32只,采用抽簽法隨機(jī)分為8組,每組4只。按照三級(jí)動(dòng)物要求,飼養(yǎng)在25℃恒溫?zé)o特定病原體(specific pathogen free,SPF)屏障系統(tǒng)內(nèi),12 h光照和12 h黑暗交替,自由進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料及飲水。將新鮮分離的SP和NSP細(xì)胞離心,PBS重懸,計(jì)數(shù),以PBS調(diào)整細(xì)胞密度為 1×103、1×104、1 ×105、1×106/mL,將不同密度SP和NSP細(xì)胞各0.1 mL接種于裸鼠右側(cè)背部皮下,每種細(xì)胞每個(gè)數(shù)量級(jí)接種4只裸鼠,觀察8周。

        ③化療藥物敏感性分析:化療藥物選擇順鉑。將新鮮分離的SP和NSP細(xì)胞接種至96孔板,1 000個(gè)細(xì)胞/孔,加入200 μL完全培養(yǎng)基,置于37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng);吸凈培養(yǎng)基,分別加入不同終濃度的順鉑(0、12.5、25、50、100、200μg/mL),每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔,其中0濃度為無(wú)藥對(duì)照,另設(shè)3孔只加培養(yǎng)液不加細(xì)胞作為調(diào)零孔。每孔培養(yǎng)基調(diào)整為200μL,置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h;從培養(yǎng)箱中取出96孔板,每孔加入已配置好的MTT 20 μL,37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h;棄去上清,每孔加入DMSO 150 μL,于振蕩器上振蕩10 min,使其徹底溶解混勻;酶標(biāo)儀讀OD490值,以只加培養(yǎng)液不加細(xì)胞的孔作為調(diào)零孔進(jìn)行調(diào)零,取3個(gè)復(fù)孔的均值為實(shí)驗(yàn)結(jié)果。計(jì)算細(xì)胞增生抑制率:細(xì)胞增生抑制率=1-實(shí)驗(yàn)組OD值/無(wú)藥對(duì)照組OD值;實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取3次抑制率的平均值。

        1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

        所有數(shù)據(jù)分析用SPSS 11.5軟件完成,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s)表示,統(tǒng)計(jì)學(xué)處理分別采用t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)、方差分析。以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 人宮頸癌細(xì)胞形態(tài)

        光學(xué)顯微鏡下,宮頸癌細(xì)胞形態(tài)符合病理學(xué)描述(圖1),符合本研究需要。

        圖1 人宮頸癌細(xì)胞Fig.1 Human cervical cancer cells(100×)

        2.2 宮頸癌SP細(xì)胞流式檢測(cè)結(jié)果

        人宮頸癌細(xì)胞染色后去除PI陽(yáng)性的死細(xì)胞,分析狀態(tài)良好的活細(xì)胞Hoechst 33342熒光染色情況。流式細(xì)胞儀可檢測(cè)到宮頸癌細(xì)胞中SP細(xì)胞的存在比例約為0.90% ~3.40%(2.04% ±0.93%),加入維拉帕米的對(duì)照管SP細(xì)胞比例下降至0%或接近0%的水平(圖2)。不同分化程度的宮頸癌細(xì)胞分別檢測(cè),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),即在檢測(cè)的高、中、低分化的宮頸癌細(xì)胞中,SP細(xì)胞比例與分化程度有關(guān),分化程度越差者其SP細(xì)胞比例越低,詳見(jiàn)表1。

        表1 不同分化程度宮頸癌細(xì)胞SP比例Tab.1 Proportion of the SP cells with different degree of cervical cancer cells

        2.3 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

        MTT法繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線,結(jié)果顯示:SP細(xì)胞與NSP細(xì)胞相比生長(zhǎng)速度較快,從第3天開始,SP細(xì)胞開始大量增生,尤其是第5天起,SP細(xì)胞明顯進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)期,而NSP細(xì)胞增生緩慢(圖3)。SP細(xì)胞和NSP細(xì)胞的增生能力差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

        2.4 裸鼠成瘤效果

        實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,SP細(xì)胞和NSP細(xì)胞的致瘤能力差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2),僅1×103個(gè)SP細(xì)胞即可形成腫瘤,平均成瘤時(shí)間(13.27±2.61)d。而至少1×105個(gè)NSP細(xì)胞才能形成腫瘤,平均成瘤時(shí)間(18.50±1.52)d。相同數(shù)量的SP細(xì)胞在同一觀察時(shí)間點(diǎn)可以形成更大的腫瘤,且形成腫瘤的潛伏期較短。

        圖2 人宮頸癌SP細(xì)胞流式檢測(cè)圖Fig.2 Expressions of cell related markers in human cervical cancer cells as detected by flow cytometry A:Hoechst 33342;B:Hoechst 33342 and verapamil;SP:side population.

        圖3 宮頸癌SP和NSP細(xì)胞生長(zhǎng)曲線Fig.3 Cell growth curve of SP cells and NSP cells

        2.5 化療藥物敏感性分析

        將SP細(xì)胞和NSP細(xì)胞分別在不同濃度的化療藥物中作用24h后,應(yīng)用MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活狀況。結(jié)果顯示:化療藥物作用后,SP和NSP細(xì)胞均出現(xiàn)一定程度的細(xì)胞死亡,但SP細(xì)胞表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐藥性,只出現(xiàn)少量細(xì)胞死亡,而NSP細(xì)胞存活明顯減少,細(xì)胞增生抑制率顯著升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表3。

        表2 宮頸癌SP和NSP細(xì)胞裸鼠的成瘤性情況Tab.2 Tumorigenicity of SP cells and NSP cells in nude mice

        表3 宮頸癌SP和NSP細(xì)胞增生抑制率情況Tab.3 Inhibition rates of SP cells and NSP cells n=9,%

        3 討論

        腫瘤干細(xì)胞是存在于腫瘤中的一小部分具有干細(xì)胞性質(zhì)的細(xì)胞群,具有自我更新能力,能夠分化成不同表型的腫瘤細(xì)胞,使腫瘤在體內(nèi)不斷擴(kuò)大或形成新的腫瘤。除此之外的其他絕大多數(shù)腫瘤細(xì)胞沒(méi)有或僅有有限的增生能力,經(jīng)短暫的分化增生后即發(fā)生凋亡。腫瘤干細(xì)胞的分離和鑒定最初來(lái)源于血液系統(tǒng)惡性腫瘤,而實(shí)體腫瘤細(xì)胞較難以分離。目前腫瘤干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)主要有2種方法,即通過(guò)細(xì)胞表面特異性標(biāo)記進(jìn)行分選和側(cè)群(SP)細(xì)胞分選法。組織特異性干細(xì)胞的嚴(yán)格分離鑒定只在少數(shù)組織中完成,許多實(shí)體組織自身的干細(xì)胞表面標(biāo)志物尚未確定,故限制了此方法的應(yīng)用。SP細(xì)胞作為一個(gè)特殊的細(xì)胞亞群,其發(fā)育和分化狀態(tài)可能介于胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞之間,具有很強(qiáng)的多向分化潛能和增生特性,且有較明確的表型標(biāo)記和分離純化方法,以SP細(xì)胞作為切入點(diǎn)來(lái)進(jìn)行宮頸癌干細(xì)胞篩選,可望為進(jìn)一步深入研究宮頸癌干細(xì)胞建立基礎(chǔ)。

        本研究選用宮頸癌原代培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行流式分選,為了剔除因維拉帕米未能完全拮抗帶來(lái)的可能誤差,SP細(xì)胞的比例取實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間的差值。結(jié)果顯示,宮頸癌細(xì)胞中存在一定數(shù)量的SP細(xì)胞,比例約為0.90% ~3.40%(2.04% ±0.93%),并可被維拉帕米阻斷,阻斷后 SP細(xì)胞比例減少至0~0.60%(0.28%±0.20%)。SP細(xì)胞的比例隨分化程度的降低而下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。迄今,有關(guān)腫瘤分化程度與SP細(xì)胞比例的關(guān)系報(bào)道較少,且意見(jiàn)不一。Brown M D等[4]研究前列腺腫瘤時(shí)發(fā)現(xiàn),腫瘤分化程度越高,其SP細(xì)胞比例越高。而Wu C等[5]發(fā)現(xiàn)分化不良的間葉源性腫瘤中的SP細(xì)胞比例高于分化良好的腫瘤細(xì)胞。目前對(duì)這一現(xiàn)象仍缺乏公認(rèn)的解釋,推測(cè)出現(xiàn)上述差異的原因可能有:①分化較差的宮頸癌細(xì)胞中SP細(xì)胞的增生能力和自我更新能力可能更強(qiáng),故只需較低比例的SP細(xì)胞即可維持腫瘤的惡性生物學(xué)行為;②分化較差的宮頸癌細(xì)胞中NSP細(xì)胞的增生能力可能更強(qiáng),在SP細(xì)胞絕對(duì)數(shù)相似的情況下,NSP細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)較大,從而導(dǎo)致其SP細(xì)胞的相對(duì)比例下降。

        作為一個(gè)特殊的細(xì)胞亞群,SP細(xì)胞具備自我更新能力和高致瘤性。Xu J X等[6]研究發(fā)現(xiàn)SP細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)可以達(dá)到1 000~5 000倍,而NSP細(xì)胞的擴(kuò)增有時(shí)甚至不能達(dá)到2倍。為了探討分選出的SP細(xì)胞是否具有腫瘤干細(xì)胞特性,我們進(jìn)行了一系列的實(shí)驗(yàn)。采用MTT法檢測(cè)SP細(xì)胞和NSP細(xì)胞的增生能力,發(fā)現(xiàn)SP細(xì)胞的增生能力顯著強(qiáng)于NSP細(xì)胞,2組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與宮頸癌NSP細(xì)胞相比,宮頸癌SP細(xì)胞具有更強(qiáng)的增生能力。在腦膠質(zhì)瘤[7]、神經(jīng)母細(xì)胞瘤[8]、鼻咽癌[9]、乳腺癌[10]、肝癌[11]等多種腫瘤的研究中均有類似發(fā)現(xiàn)。但也有學(xué)者對(duì)這一現(xiàn)象提出質(zhì)疑,認(rèn)為NSP細(xì)胞在分選后增生較差,可能與分選采用的Hoechst 33342對(duì)NSP細(xì)胞的毒性作用有關(guān)[12],然而,Hoechst 33342 染料的半衰期較短,且在分裂過(guò)程中難以大量傳入子代細(xì)胞中而影響其增生[13],單純以Hoechst 33342染料的毒性作用來(lái)解釋上述現(xiàn)象難以令人信服。為了探求宮頸癌SP細(xì)胞的致瘤能力,我們采用NOD/SCID小鼠行皮下接種成瘤實(shí)驗(yàn),把不同數(shù)量級(jí)的SP和NSP細(xì)胞移植到NOD/SCID小鼠皮下,發(fā)現(xiàn)SP細(xì)胞的成瘤能力明顯強(qiáng)于NSP細(xì)胞。

        大量臨床和基礎(chǔ)研究[2,7-8]顯示,各種腫瘤對(duì)化療藥物的敏感性不一,許多腫瘤經(jīng)過(guò)手術(shù)和藥物治療,腫瘤已經(jīng)幾乎消失,但是,很快又復(fù)發(fā)了。根據(jù)干細(xì)胞學(xué)說(shuō)[14],干細(xì)胞一般對(duì)化療藥物耐藥,能夠排除化療藥物的毒性,從而成功逃避化療藥物的作用,從而存活下來(lái)。雖然大部分腫瘤細(xì)胞被殺死了,但是只要腫瘤干細(xì)胞還存在,腫瘤就會(huì)很容易復(fù)發(fā)。因此探討腫瘤細(xì)胞的耐藥性,尋找腫瘤復(fù)發(fā)的原因,為腫瘤化療提供新的靶點(diǎn),具有重要的臨床意義。由于在部分組織中SP細(xì)胞表型產(chǎn)生的主要因素是ABCG2/BCRP1的表達(dá),而ABCG2/BCRP1又是主要的耐藥蛋白[15],故我們推測(cè),SP細(xì)胞可能和宮頸癌的化療耐藥相關(guān)。我們用MTT法檢測(cè)化療藥物順鉑對(duì)SP和NSP細(xì)胞生長(zhǎng)的作用,發(fā)現(xiàn)順鉑對(duì)NSP細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制明顯,對(duì)SP細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制不明顯,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這個(gè)結(jié)果支持SP細(xì)胞可能和宮頸癌化療耐藥相關(guān)的假設(shè)。

        本研究應(yīng)用流式細(xì)胞儀分選宮頸癌SP細(xì)胞,經(jīng)各種體內(nèi)、外鑒定實(shí)驗(yàn)證實(shí),宮頸癌SP細(xì)胞具有腫瘤干細(xì)胞的生物學(xué)特性,生長(zhǎng)速度快,自我更新和分化能力強(qiáng),且具有強(qiáng)大的致瘤性和耐藥性,可作為宮頸癌干細(xì)胞研究的切入點(diǎn),為宮頸癌干細(xì)胞的靶向治療深入研究提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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