王慶輝，馮永輝，劉 軍，李 瑩，曹雅明，呂昌龍

(1.中國醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院免疫學教研室，遼寧 沈陽 110001;2.沈陽市胸科醫(yī)院檢驗科，遼寧 沈陽 110044)

接觸性超敏反應(Contact hypersensitivity，CHS)是用來研究人類過敏性接觸性皮炎(Allergic contact dermatitis，ACD)免疫機制的實驗動物模型，同時，也是研究體內(nèi)免疫活化和調(diào)節(jié)的重要模型之一。而且，很大程度上用此模型研究免疫機制比研究ACD疾病本身更加寬泛［1］。CHS是由于接觸低分子量半抗原而引發(fā)的皮膚炎癥性改變，屬于一種T細胞介導的遲發(fā)型超敏反應，即Ⅳ型超敏反應。近年來，研究表明分泌IL-17的CD4+Th(Th17)細胞亞群在CHS發(fā)展過程中也發(fā)揮重要作用［2-3］。雖然大多數(shù)人在每天的生活中都會不斷地接觸潛在的致敏物質(zhì)，但最終并不發(fā)展成CHS;而且就是在過敏的個體，過敏反應的程度也是隨時間而波動的，并且可以自愈。這些觀察結(jié)果表明，機體對化學物質(zhì)導致的接觸過敏具有精細而復雜的調(diào)節(jié)機制［4］。CD4+CD25+FoxP3+調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)是近年來發(fā)現(xiàn)的具有較強免疫調(diào)控作用的T細胞亞群，在誘導和維持免疫耐受及終止免疫反應的過程中發(fā)揮中心作用。Treg與效應T細胞之間必須保持平衡以維持足量而適當?shù)拿庖叻磻?。為此，本實驗利用?CD25 mAb 7D4在小鼠體內(nèi)消除Treg，以研究內(nèi)源性Treg對CHS過程的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 6～8周齡，雌性，C57BL/6小鼠(本校實驗動物部提供)。

1.1.2 主要試劑 氯化苦咪酸(Trinitrochlorobenzene，TNCB)(Sigma);抗-CD4-FITCmAb(GK1.5)、抗-CD25-PE mAb(PC61)、抗-IL-17-Alexa Flour?647 mAb(TC11-18H10)、細胞因子固定透膜劑和FcγIII/II封閉抗體(2.4G2)均購自美國BD公司;抗-Foxp3-APC mAb(FJK-16S)和FoxP3胞內(nèi)染色試劑盒，購自美國eBioscience公司?？?CD25 mAb(clone 7D4)由本實驗室制備。

1.1.3 主要儀器 FACSCalibur流式細胞儀(Becton-Dickinson);CO2孵箱(Harasawa，Japan);千分尺(Mitutoyo)。

1.2 方法

1.2.1 模型制備 C57BL/6小鼠(6～8周齡，雌性)給予5%TNCB經(jīng)去毛的腹部涂抹致敏，1周后給予1%TNCB進行耳部皮膚攻擊，攻擊24 h后連續(xù)3日監(jiān)測小鼠耳緣皮膚厚度，建立CHS小鼠模型。在TNCB耳部攻擊之前，致敏小鼠隔日經(jīng)腹腔注射1 mg抗-CD25 mAb(clone 7D4)2次，以消除小鼠體內(nèi)Treg，建立相應的Treg消除CHS鼠模型。小鼠耳緣皮膚增厚(μm)=攻擊后耳緣皮膚厚度－攻擊前耳緣皮膚厚度。

1.2.2 流式細胞儀檢測 無菌取小鼠頸和腋窩淋巴結(jié)，常規(guī)方法制備細胞懸液，用含10%胎牛血清(FCS)的RPMI-1640調(diào)整細胞終濃度為1×107/mL。取0.1 mL細胞懸液，預先加入 FcγⅢ/Ⅱ封閉抗體(2.4G2)1 μg 封閉 30 min。為檢測CD4+CD25+FoxP3+Treg，每份樣品同時用抗-CD4-FITC mAb和抗-CD25-PE mAb進行細胞表面雙色標記，4℃孵育30 min。洗滌后，加0.25 mL FoxP3固定透膜劑，4℃孵育30 min。洗滌后，再加入抗-Foxp3-APC mAb進行胞內(nèi)染色，4℃孵育30 min，待流式細胞儀檢測。為檢測產(chǎn)生IL-17的CD4+T細胞，淋巴細胞在Golgi Stop存在下經(jīng)PMA和離子霉素刺激5 h，然后樣本經(jīng)抗-CD4-FITC mAb表面染色后，加入0.25 mL細胞因子固定透膜劑，4℃孵育50 min，洗滌后，加入抗-IL-17-Alexa Flour?647 mAb，4 ℃ 孵育 30 min，進行胞內(nèi)細胞因子染色，待流式細胞儀檢測。每種檢測均設陰性對照和各種熒光抗體的單標管。利用流式細胞儀獲取細胞，使用前向散射角(FSC)及側(cè)向散射角(SSC)確定淋巴細胞群。以陰性對照為參考，將對照管所示的非特異熒光的99% 以上作為本底扣除，以單標管為對照，調(diào)整不同熒光通道補償。每個樣品獲取10000～20000個細胞。結(jié)果以二維點陣圖顯示。分析Treg時，首先以CD4+細胞劃門，分析門內(nèi)CD25+FoxP3+細胞占CD4+細胞的比例。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠耳緣厚度和Treg數(shù)量的動態(tài)監(jiān)測

C57BL/6小鼠腹部經(jīng)5%TNCB致敏1周后，小鼠右耳經(jīng)1%TNCB再次攻擊。如圖1所示，攻擊24 h后，小鼠右耳耳緣皮膚厚度顯著增加，48 h達到峰值，72 h有所回落，表明CHS炎癥模型成功建立。與此同時，TNCB攻擊后小鼠淋巴結(jié)中Treg占CD4+T細胞的百分比也顯著增高，于24～48 h達到峰值，72 h開始回落。

圖1 TNCB誘導的CHS小鼠耳緣厚度和Treg的動態(tài)監(jiān)測Fig.1 Dynamic change in ear thickness and Treg of mice in TNCB induced CHS

2.2 Treg消除效果的檢測

經(jīng)腹腔注射抗-CD25 mAb(clone 7D4)，檢測TNCB攻擊24 h后小鼠淋巴結(jié)中CD4+CD25+FoxP3+Treg的表達。如圖2所示，與對照組相比，Treg消除組CD4+CD25+FoxP3+Treg占CD4+細胞的百分比顯著降低(P＜0.05)，消除效率大于60%。

圖2 7D4抗體注射后小鼠淋巴結(jié)CD4+CD25+FoxP3+Treg的表達Fig.2 The percentage of CD4+CD25+FoxP3+Treg in lymph nodes of mice treated with 7D4 antibody

2.3 Treg消除對CHS的影響

腹腔注射抗-CD25 mAb(clone 7D4)后，檢測TNCB攻擊24 h后小鼠耳緣皮膚厚度的變化。Treg消除組小鼠耳緣皮膚厚度的增加值顯著高于對照組(圖3)。與此同時，雖然Treg消除組小鼠CD4+T細胞占淋巴細胞的百分比沒有顯著性變化(圖4)，但是產(chǎn)生IL-17的CD4+T細胞的百分比較對照組顯著增高(圖5)。

圖3 7D4抗體注射后小鼠耳緣皮膚增厚Fig.3 The increase in ear thickness in mice treated with 7D4 antibody

圖4 7D4抗體注射后CD4+T細胞比例Fig.4 Percentage of CD4+cell in mice treated with 7D4 antibody

圖5 7D4抗體注射后CD4+IL-17+細胞比例Fig.5 Percentage of CD4+IL-17+cell in mice treated with 7D4 antibody

3 討論

自1995年Sakaguchi首次報道組成性表達CD25的Treg以來，這群細胞已在自身免疫性疾病、腫瘤和移植物抗宿主病等多種病理模型中顯示重要的免疫調(diào)控作用。近年來，CD4+CD25+FoxP3+Treg在CHS模型中的作用也日益受到研究者的關注。紫外線照射可誘導免疫抑制，從而達到治療各種皮膚疾病的目的。研究表明這種治療作用是通過誘導 Treg的擴增而實現(xiàn)的［5］。Ring等［6］通過給TNCB-致敏小鼠靜脈輸注純化的CD4+CD25+Treg，可明顯抑制小鼠受攻擊部位皮膚的厚度和炎癥細胞浸潤。本實驗結(jié)果顯示在TNCB誘導的小鼠CHS模型中，伴隨炎癥的出現(xiàn)，Treg的比例也呈現(xiàn)有意義的增高;進一步利用抗-CD25 mAb 7D4在小鼠體內(nèi)消除Treg后，小鼠的皮膚炎癥則更加明顯，同時CD4+IL-17+T細胞比例顯著增加，由此提示Treg可能通過影響效應性Th17的功能，進而抑制CHS的發(fā)生。

Th17細胞是一類以表達 IL-17為特征的CD4+T細胞亞群，具有明顯的致炎效應。IL-17－/－小鼠CHS的反應和炎細胞的浸潤程度均低于野生對照小鼠［7］;利用抗IL-17抗體進行體內(nèi)阻斷，也表明IL-17在CHS的效應階段發(fā)揮重要作用［8］。由于 Treg和 Th17細胞均屬于 CD4+T細胞亞群，而且二者的功能相對，因此推測在CHS的反應中Treg和Th17存在一種動態(tài)平衡，調(diào)節(jié)機體的炎癥反應程度。當Treg的功能被削弱時，Th17通過分泌IL-17促進炎癥的發(fā)生，其具體的調(diào)控機制還有待進一步深入研究。

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