王美蓮，劉 兵，史俊巖，鄭蘭艷，羅恩杰

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)教研室，遼寧 沈陽 110001)

漢坦病毒(hantaan virus，HV)屬于布尼亞病毒科漢坦病毒屬，由其引起的人類腎綜合癥出血熱(hemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS)是一類以發(fā)熱、出血和腎功能損傷為特征的急性傳染病，病死率達(dá)0.1% ～10%［1］。病毒不僅可以直接引起全身小血管和毛細(xì)血管損傷、血管通透性增加和微循環(huán)障礙，還可引起免疫應(yīng)答異常，進(jìn)而引發(fā)高熱、出血及腎損害等臨床癥狀。漢坦病毒主要編碼基因由S、L、M 3條單鏈負(fù)股RNA組成，它們分別編碼漢坦病毒核蛋白、RNA聚合酶、糖蛋白，而含M基因的重組體DNA可誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體，并且對(duì)病毒株的攻擊有保護(hù)力。目前研究者已經(jīng)對(duì)核蛋白的作用作了較深入的研究［2-3］。但對(duì)糖蛋白的研究相對(duì)較少。漢坦病毒M2基因上含有較多的抗原決定簇，因此如果可以大量的人工合成并提取G2蛋白對(duì)漢坦病毒糖蛋白單克隆抗體的研究及應(yīng)用有重要的意義。本實(shí)驗(yàn)以原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-6P-1為載體，構(gòu)建了含有漢坦病毒76-118株編碼囊膜糖蛋白G2抗原基因片段的原核表達(dá)載體pGEX-6P-1-M2，通過研究其在原核細(xì)胞中的表達(dá)，探討漢坦病毒糖蛋白在篩選單克隆抗體及研制試劑盒中的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 原核表達(dá)載體pGEX-6P-1、漢坦病毒76-118 株 M 片段、E.coli DH5α、E.coli BL21為本教研室保存。

1.1.2 引物的設(shè)計(jì)與合成 引物參照GenBank設(shè)計(jì)，由沈陽博奧春天生物公司設(shè)計(jì)并合成。序列如下:上游引物:5'-CGTGTTACCGGACACTAA-3'，BamHⅠ酶切位點(diǎn);下游引物:5'-CCGAGTCACAGAATTTAGC-3'，XhoⅠ 酶 切位點(diǎn)。

1.1.3 主要試劑 限制性內(nèi)切酶 EcoRⅠ及T4DNA連接酶、DL 15000 DNA Marker、小量 DNA純化試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、預(yù)染蛋白Marker購自大連TaKaRa公司;辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗人抗體、瓊脂糖購自BIOWEST公司。

1.2 方法

1.2.1 融合蛋白表達(dá)載體pGEX-6P-1/M2的構(gòu)建 以漢坦病毒76-118株M基因?yàn)槟０暹M(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增得到含完整編碼漢坦病毒G2蛋白基因M2的1600 bp DNA片段，凝膠回收后－20℃保存。

1.2.2 質(zhì)粒pMD18-M2的構(gòu)建 將上述PCR產(chǎn)物與T載體pMD18分別經(jīng)XhoⅠ和BamHⅠ消化后，在連接酶的作用下16℃連接約16 h。連接產(chǎn)物10 μL轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸埃希菌DH5α，鋪LB平板并加入氨卞青霉素(1 μg/mL)，37℃培養(yǎng)16 h;篩選陽性菌落擴(kuò)增培養(yǎng)，以堿裂解法小量提取重組質(zhì)粒后，儲(chǔ)存于－20℃。

1.2.3 原核表達(dá)載體 pGEX-6P-1-M2的構(gòu)建將重組質(zhì)粒及原核表達(dá)載體pGEX-6P-1均用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切后在T4DNA連接酶作用下于16℃連接約16 h。連接產(chǎn)物10 μL轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸埃希菌DH5α，鋪LB平板并加入氨卞青霉素(1 μg/mL)，37 ℃培養(yǎng)16 h。

1.2.4 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化、篩選及鑒定 按常規(guī)方法，將連接后所得的重組子轉(zhuǎn)化入感受態(tài)宿主菌E.coli BL-21，在含氨芐青霉素LB平板上鋪板，37℃溫箱過夜培養(yǎng)。第2天從平板上挑取菌落接種于含氨芐青霉素的5 mL LB液體培養(yǎng)基，37℃搖床震蕩培養(yǎng)5 h，快速堿裂解法粗提質(zhì)粒，－20℃保存。

1.2.5 重組蛋白GST-G2的誘導(dǎo)表達(dá)和純化將含重組質(zhì)粒pGEX-6P-1-M2的大腸埃希菌BL-21接種于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，于37℃振蕩培養(yǎng)過夜。次日將過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接于1000 mL含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，繼續(xù)在37℃振蕩培養(yǎng)約3 h。加入 IPTG至終濃度為0.1 mmol/L，置37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，離心，收集菌體。加細(xì)菌裂解緩沖液超聲裂解細(xì)菌，離心取上清，對(duì)融合蛋白進(jìn)行親和層析純化。

1.2.6 SDS-PAGE電泳及 Western-Blot分析 取純化后的蛋白產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳，1 h后，取下凝膠進(jìn)行轉(zhuǎn)印，PVDF膜經(jīng)TBS液洗滌10 min后，封閉液封閉1 h，再以TTBS洗滌2次。加入用1∶200封閉液稀釋的患者血清，4℃孵育過夜，經(jīng)TBS、TTBS洗滌后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗 37℃ 孵育 2 h，TTBS、TBS洗滌，DAB顯色。

2 結(jié)果與分析

2.1 M2基因片段的擴(kuò)增

經(jīng)PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳可見1條約1600 bp的特異性擴(kuò)增區(qū)帶，與預(yù)期結(jié)果一致(圖1)。

圖1 PCR產(chǎn)物M2的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of PCR products M2

2.2 pMD18-M2重組質(zhì)粒的酶切鑒定

用EcoRⅤ和BamHⅠ雙酶切質(zhì)粒，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳證明重組質(zhì)粒帶有相應(yīng)的目的基因(圖2)。質(zhì)粒交由北京三博遠(yuǎn)志生物公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果與GenBank中的M2核苷酸序列進(jìn)行比較，同源性達(dá)98%，開放讀碼框正確。

圖2 pMD18-M2重組質(zhì)粒的酶切鑒定Fig.2 Results of recombinant plasmid pMD18-M2

2.3 pGEX-6P-1-M2重組質(zhì)粒的酶切鑒定

從陽性克隆中提取重組質(zhì)粒，經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切后得到4900 bp和1600 bp 2條帶，表明M2基因已克隆于pGEX-6P-1載體中(圖3)。

圖3 pGEX-6P-1-M2重組質(zhì)粒的酶切鑒定Fig.3 Results of recombinant plasmid pGEX-6P-1-M2

2.4 融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化

SDS-PAGE電泳結(jié)果可見與預(yù)期融合蛋白分子量大小相符的蛋白條帶(圖4)。Western-Blot分析進(jìn)一步表明該蛋白條帶為GST-G2融合蛋白(圖5)。

圖4 pGEX-6P-1-M2重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)及純化SDS-PAGEFig.4 SDS-PAGE result of inducted expression and purification for recombined bacteria pGEX-6P-1-M2

圖5 Western-Blot結(jié)果Fig.5 Result of Western-Blot

3 討論

漢坦病毒糖蛋白由 G1、G2組成，其具有重要的生物學(xué)功能，除了能與細(xì)胞膜上受體黏附、融合之外，更重要的是具有誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的抗原決定簇。最近發(fā)現(xiàn)，包膜糖蛋白上亦含有 CTL的表位［4］。對(duì)抗糖蛋白G1或G2的單克隆抗體研究發(fā)現(xiàn)，只有識(shí)別糖蛋白G2的單克隆抗體能產(chǎn)生血凝抑制反應(yīng)，體外具有中和病毒抗原活性，而針對(duì)核殼蛋白(NP)的單克隆抗體絕大多數(shù)無中和活性［5-6］。雖然人們普遍認(rèn)為漢灘病毒G2上的抗原位點(diǎn)對(duì)空間結(jié)構(gòu)和糖基化依賴性較大，但仍然存在一定的由一級(jí)結(jié)構(gòu)決定的中和位點(diǎn)。

本研究以pGEX-6P-1為載體，以編碼漢坦病毒G2蛋白的M2基因?yàn)槟康幕?，?gòu)建原核表達(dá)載體pGEX-6P-1/M2，酶切和序列分析結(jié)果表明成功構(gòu)建原核表達(dá)載體pGEX-6P-1/M2。為了獲得足夠量的蛋白用以進(jìn)一步的研究，選用簡(jiǎn)便、高效及生產(chǎn)成本低的原核表達(dá)系統(tǒng)載體pGEX-6P-1。表達(dá)載體一般分為原核和真核兩大類，是外源基因在宿主細(xì)胞中進(jìn)行蛋白表達(dá)的主要工具，是將克隆的外源基因在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)成蛋白質(zhì)的載體。原核表達(dá)載體系統(tǒng)包括大腸埃希菌和枯草桿菌系統(tǒng)等，真核表達(dá)載體系統(tǒng)包括酵母、昆蟲細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)等［7］。大腸埃希菌表達(dá)系統(tǒng)使用最早也研究最多，并且其遺傳背景相對(duì)比較清楚，使用安全、操作簡(jiǎn)便、周期短［8］。大腸埃希菌表達(dá)載體有非融合表達(dá)、融合表達(dá)、分泌表達(dá)、帶純化標(biāo)簽表達(dá)、帶伴同蛋白表達(dá)和表面呈現(xiàn)表達(dá)等［9］。融合蛋白是將2個(gè)各自獨(dú)立的基因，通過表達(dá)載體使之連接成一體，表達(dá)2種不同蛋白的融合體。融合表達(dá)具有多方面的優(yōu)點(diǎn):如防止包涵體的形成，促進(jìn)蛋白質(zhì)的正確折疊，限制蛋白酶解和利于純化［10-11］。近年來，融合蛋白表達(dá)系統(tǒng)的發(fā)展為E.coli中高效表達(dá)和純化重組蛋白提供了極大方便，GST(glutathione stransferase)是目前成功的融合表達(dá)系統(tǒng)［12-15］。原核表達(dá)載體pGEX-6P-1具有:①含有tac啟動(dòng)子，可使被克隆的基因得到可誘導(dǎo)的高水平表達(dá);②含有l(wèi)ac Iq基因，適用于任何大腸埃希菌宿主;③含有凝血酶或Xa因子蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)，可使目的蛋白從表達(dá)的融合蛋白中達(dá)到分離純化。SDS-PAGE電泳顯示，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的重組原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-6P-1/M2在大腸埃希菌BL-21中獲得了高效表達(dá)的融合蛋白，證明原核表達(dá)載體pGEX-6P-1適用于漢坦病毒M2基因的原核表達(dá)研究。

通過Western-Blot分析融合蛋白GST-G2，結(jié)果證實(shí)重組蛋白GST-G2具有抗原性。

總之，本研究中以原核表達(dá)載體pGEX-6P-1為載體，成功構(gòu)建了漢坦病毒M2基因原核表達(dá)載體，并獲得了高效表達(dá)的具有生物學(xué)活性的重組融合蛋白，為將來篩選漢坦病毒抗體庫以及漢坦病毒早期診斷試劑盒的研制奠定了基礎(chǔ)。

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