朱文華，董冠群，滕長財，侯 娟，呂 彥，孫業(yè)盈*

(1.濱州醫(yī)學院 藥學院，山東 煙臺 264003;2.煙臺大學 生命科學學院，山東 煙臺 264005)

中度嗜鹽菌(modrately halophilic bacteria)近年來正受到越來越多的重視，與此相關(guān)的中度嗜鹽菌的分離，鑒定，基因組學研究以及耐鹽機理的研究也日益廣泛和深入。中度嗜鹽菌是生活在極端高鹽環(huán)境中的微生物，具有較強的耐鹽能力，能在含有0% ～32%NaCl的環(huán)境中生長，最適鹽度為3% ～15%［1-2］。中度嗜鹽菌廣泛分布在不同的高鹽環(huán)境中如鹽湖、海洋、鹽堿地和鹽漬發(fā)酵食品等［3-6］。嗜鹽細菌主要通過2種機制來適應(yīng)高滲透壓的外界環(huán)境:一種是通過在細胞內(nèi)積累高濃度的鹽離子如KCl和NaCl等，來使細胞內(nèi)的滲透壓升高，從而平衡外界環(huán)境的高滲透壓，如Halobacteriaceae和Salinibacter類嗜鹽菌都是通過此機制來實現(xiàn)耐鹽的;另一種是通過在細胞內(nèi)合成或者積累高濃度的相容性溶質(zhì)，來升高細胞內(nèi)的滲透壓，抗衡細胞外的高滲透壓對細胞的影響［7］。雖然，目前研究人員已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了部分嗜鹽菌的耐鹽策略，但是對其如何通過怎樣的基因表達調(diào)控網(wǎng)絡(luò)來實現(xiàn)這一過程還不清楚。因此對嗜鹽菌進行深入的基因組學，轉(zhuǎn)錄組學和蛋白組學的研究，發(fā)掘克隆相關(guān)的基因，對它們進行功能研究就顯得尤其重要。先前的研究中從蜢子蝦醬中分離純化鑒定了1株中度嗜鹽菌，通過測定其16S rDNA序列，并通過系統(tǒng)發(fā)育分析將該菌初步鑒定為枝芽胞桿菌屬(Virgibacillus)中的鹽脫氮枝芽胞桿菌(Virgibacillus halodenitrificans)［8］。本研究進一步通過構(gòu)建該中度嗜鹽菌的質(zhì)?；蚪M文庫，經(jīng)測序，比對分析克隆了2個膜蛋白基因，并對它們進行了生物信息學的相關(guān)分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 嗜鹽菌提取于天然發(fā)酵的蜢子蝦醬，購買于山東省煙臺市煙臺大學農(nóng)貿(mào)市場。質(zhì)粒pUC19，具有氨芐青霉素抗性。

1.1.2 試劑 HindⅢ-HF內(nèi)切酶、T4DNA連接酶購自 NEB公司;Taq酶、CIAP(Alkaline Phosphatase)購自TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 細菌DNA的提取，酶切與酶切片段純化用BioTeKe Corporation細菌基因組提取試劑盒提取嗜鹽菌MKY20的總DNA，然后用限制性內(nèi)切酶HindⅢ-HF處理，建立50 μL的反應(yīng)體系，酶切2 μg細菌基因組DNA;將酶切片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Exraction Kit回收片段大小為1.5～9 kb的DNA片段。

1.2.2 載體制備 提取適量的pUC19質(zhì)粒以限制性內(nèi)切酶HindⅢ-HF完全酶切后，試劑盒回收，然后用CIAP進行去磷酸化處理，抑制質(zhì)粒的自身環(huán)化，降低假陽性克隆的比率。

1.2.3 連接與轉(zhuǎn)化 通過T4DNA連接酶連接經(jīng)脫磷酸處理的pUC19質(zhì)粒載體與酶切DNA片段。將得到的連接產(chǎn)物加入到100 μL大腸埃希菌感受態(tài)細胞中，置冰浴30 min;冰浴后放入42℃的恒溫水浴鍋中熱擊90 s，熱擊處理后迅速加入0.7 mL LB培養(yǎng)液，放置在37℃的恒溫搖床中震蕩培養(yǎng)1 h，然后取0.1 mL轉(zhuǎn)化菌液涂布固體LB平板于37℃過夜培養(yǎng)。

1.2.4 載體插入片段大小的鑒定 隨機挑取轉(zhuǎn)化培養(yǎng)的單克隆，以其 DNA為模板，利用M13(47)和M13(48)引物進行菌落PCR，然后把PCR擴增后產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，和DNA Maker比對確定片段大小。

1.2.5 測序與比對分析 隨機選取一定數(shù)量的插入片段的克隆，送上海美吉生物科技公司測序。經(jīng)生物學軟件分析，篩選具有完整的開發(fā)閱讀框(ORF)的克隆。用DNASTAR軟件推導ORF編碼的氨基酸序列，提交到GenBank進行BLAST比對，對ORF所編碼的蛋白質(zhì)的同源性進行分析。將部分ORF編碼的氨基酸序列和其它物種的該蛋白的氨基酸序列用ClustalW比對?？缒^(qū)的預(yù)測通過在線程序 http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 中度嗜鹽菌基因組DNA的提取，酶切和片段富集

提取中度嗜鹽菌MKY20總DNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，結(jié)果如圖1，DNA片段大小在23.1 kb左右。用限制酶 HindⅢ-HF酶切總DNA，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖2，第一泳道所示，片段大小不一，彌散分布。切膠回收1.5～9 kb之間的片段，經(jīng)電泳檢測，如圖2第二泳道所示，結(jié)果表明大片段明顯集中，去除掉了小于1.5 kb的片段。

2.2 質(zhì)?；蚪M文庫的構(gòu)建及陽性克隆的檢測

酶切后回收大小在1.5～9 kb的片段，然后與PUC19質(zhì)粒載體(經(jīng)HindⅢ-HF酶切并進行去磷酸化處理)連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5a，構(gòu)建中度嗜鹽菌MKY20的質(zhì)?；蚪M文庫。隨機挑選轉(zhuǎn)化單克隆菌落，用載體引物M13(47)和M13(48)進行PCR擴增，鑒定插入片段大小，經(jīng)凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖3所示，插入片段大小都在2～4 kb，重組質(zhì)粒占總轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的90%以上，證明了基因組質(zhì)粒文庫的可靠性。由此估算該基因組文庫的容量大約為5×103個克隆，以平均每個克隆插入3 kb計算，該文庫可覆蓋約15 Mb的遺傳信息。

2.3 NhaC基因的克隆及序列分析

從中度嗜鹽菌MKY20的質(zhì)?；蚪M文庫中某個隨機測序的克隆中獲得了一完整的ORF，經(jīng)過BLAST比對分析表明該ORF所編碼的蛋白質(zhì)與Na+H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白(Na+H+antiporter，NhaC)相似，該蛋白存在于單細胞的原核生物到多細胞的真核生物的細胞質(zhì)膜上，起到調(diào)節(jié)細胞內(nèi)pH值和Na+濃度的功能［9-11］。進一步的生物信息學分析表明中度嗜鹽菌MKY20 NhaC基因全長ORF為1446 bp，編碼481個氨基酸的蛋白質(zhì)，推測的分子量為50.5 ku，共10個跨膜區(qū)域(圖4)，GenBank登陸號為JX849200。

2.4 MscS基因的克隆及進化分析

在質(zhì)粒基因組文庫中隨機測序的克隆中獲得了另外一個具有完整的ORF的克隆，經(jīng)BLAST比對分析表明該ORF所編碼的蛋白質(zhì)分別與一離子通道蛋白(small conductance mechanosensitive channel，MscS)具有較高的同源性。該MscS基因的全長ORF為822 bp，編碼273個氨基酸的蛋白質(zhì)，推測分子量為 30.0 ku，GenBank登陸號為JX849202。采用ClustalW軟件，對該菌的MscS蛋白的氨基酸序列與GenBank中其他4種菌的MscS蛋白相應(yīng)氨基酸序列進行了比對分析(圖5)，結(jié)果表明中度嗜鹽菌MKY20的MscS蛋白與其他4種菌的MscS蛋白有較高的同源性，并且都具有3個跨膜區(qū)，其中第3個跨膜區(qū)的氨基酸序列最保守。

圖5 不同菌屬MscS蛋白氨基酸序列的比對分析Fig.5 Alignment analysis of MscS amino acid sequence from different species

3 討論

本研究的實驗對象是從蜢子蝦醬中分離出來的1株中度嗜鹽菌，經(jīng)16S rDNA測序比對以及生理生化的鑒定，確定為鹽脫氮枝芽胞桿菌(Virgibacillus halodenitrificans)。目前，還沒有該菌種基因組學方面的研究報道。細菌的基因組大小一般在4 M左右，因此本研究在構(gòu)建鹽脫氮枝芽胞桿菌基因組文庫時選擇了能夠承載幾個kb的質(zhì)粒載體。由于小片段包含的遺傳信息比較小，并且小片段相比大片段插入質(zhì)粒的概率要大的多，因此為了使每個克隆盡可能的包含更多的遺傳信息，在構(gòu)建文庫之前，對酶切的基因組片段進行了篩選，只選擇了大于1.5 kb的酶切片段進行文庫構(gòu)建，文庫鑒定結(jié)果也表明所構(gòu)建的基因組文庫的克隆中插入片段均大于1.5 kb，這樣就保證了每個克隆的遺傳信息的承載量，便于從克隆中篩選基因全長。

Na+H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白(antiporter)是存在于質(zhì)膜上的一類蛋白家族，在包括微生物、植物、動物和人中都存在，它們在維持細胞內(nèi)部pH、Na+濃度等方面起著重要的調(diào)節(jié)作用［9］。在植物和微生物的研究中均已表明Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白是生物耐鹽的關(guān)鍵因子，能夠維持高鹽脅迫下生物體的正常生長代謝［10-11］。本研究中從鹽脫氮枝芽胞桿菌的質(zhì)?；蚪M文庫中篩選到Na+H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白，經(jīng)比對分析確定為NhaC，鑒于NhaC在其他微生物中已被證明具有耐鹽功能［12］，因此本研究所克隆的鹽脫氮枝芽胞桿菌的NhaC基因可作為該菌的一個候選耐鹽基因。機械敏感性離子通道(Mechanosensitive(MS)ion channels)存在于從單細胞的微生物到多細胞的動植物的質(zhì)膜中，可以察覺細胞外的機械性的脅迫如重力，接觸等，還可以對細胞內(nèi)環(huán)境如滲透壓力和膜損傷起反應(yīng)［13］。大腸埃希菌是目前研究機械敏感性離子通道的最好模型，該蛋白可以分為2類，一類是MscL(Mechanosensitive channel of Large conductance)，另一類是MscS(Mechanosensitive channel of Small conductance)［13］。研究表明MS通道在細菌滲透脅迫中具有重要的保護作用［14］，因此，推測MS通道在高鹽環(huán)境中生存的微生物自我保護也是必不可少的。在鹽脫氮枝芽胞桿菌的質(zhì)?；蚪M文庫中篩選到了一MscS基因，故該基因也可作為該菌的一個耐鹽候選基因。鹽脫氮枝芽胞桿菌質(zhì)?；蚪M文庫的構(gòu)建以及2個膜蛋白基因的克隆，將為進一步研究鹽脫氮枝芽胞桿菌的耐鹽機制，及其在鹽漬食品中的作用提供了基礎(chǔ)。

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